الکتروفورز دو بعدی چیست

الکتروفورز روشی است که در آن نمونههایی که بار الکتریکی دارند، تحت تأثیر یک میدان الکتریکی از میان شبکه ایمتخلخل حرکت می کنند و از یکدیگر جدا می شوند. سیر تکوین وتکامل این روشدر جداسازی پروتئینها ارتباط تنگاتنگی با تلاشهای انجام شده در بررسیپروتئینهای سرم دارد.


در سال1937،
"Tiselius" روشی برای جداسازی الکتروفورتیک پروتئینهای سرمابداع کرد. انگیزه اصلی برای طراحی این روش، که بعدها به الکتروفورز منطقهای " Zone Electrophoresis" مشهور شد، مشکلاتی بود که درحین بررسیپروتئینهای سرم وجود داشت. "Tiselius" برای اولین بار فراکشن های آلفا ،بتا، و گاما را در سرم تشریح و نام گزاری کرد. وی به خاطر تحقیق بر رویالکتروفورز و آنالیز جذبی، بخصوص اکتشافاتی که ماهیت پیچیده ی پروتئینهایسرم را مشخص می کرد، جایزه ی نوبل شیمی را در سال 1948 از آن خود کرد.

نقطه ی عطف در توسعة الکتروفورز در دهه های 40 و 50 زمانی روی داد که
علاوه بر الکتروفورز منطقه ای دو روش دیگر نیز ظهور کردند: ایزوالکتروفوکوسینگ ", IEFIsoelectrofocusing" و ایزوتاکوفورزیز " Isotachophoresis". بنابراین در آن زمان امکان انجام آنالیزهای جداسازیالکتروفورتیک سه گانه بر روی مخلوطهای پروتئینی یا بصورت جدا یا در ترکیببا همدیگر بوجود آمد.

اولین تجارب در جداسازی توسط الکتروفورز دوبعدی به کارهای
Smithies و Poulik در سال 1956 باز می گردد که با بکار بردنِ ترکیبی از الکتروفورز برروی کاغذ و بر روی ژل نشاسته پروتئین های سرم را جداو تفکیک کردند.

پیشرفتهای بعدی در فناوری الکتروفورز، نظیر استفاده از پلی آکریل آمید و
استفاده از شیبهای غلظتی پلی آکریل آمید، به سرعت در جداسازی های دو بعدیبه کار گرفته شد. به خصوص استفاده از"IEF" در جداسازی دو بعدی این امر راامکان پذیر ساخت که جداسازی بُعد اول بر پایه خصوصیات بار الکتریکی پروتینها صورت پذیرد. در سال 1970 الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید به همراه سدیمدو دسیل سولفات " Sodium Dodecylsulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE" توسط "Laemmli" معرفی شد. ترکیب "IEF" با "SDS-PAGE" در بُعد دوم منجر به ابداع روشی گشت که پروتئین ها را بر پایهدوعامل متفاوت یعنی بار الکتریکی و جرم مولکولی از یکدیگر جدا می ساخت. این روش برای انواع متفاوتی از نمونه ها با خواص حل پذیری متفاوت انطباقیافت؛ بدین معنی که استفاده از اوره و دترجنت های غیریونی در "IEF"، امکانمحلول سازی نمونه های متفاوت را فراهم نمود. بدین ترتیب تا سال 1975 یکسیستم الکتروفورز دوبعدی تکامل یافت که می توانست برای آنالیز مخلوط هایپروتئینی بدست آمده از کلِ یک سلول یا بافت ها بکار گرفته شود. براساس اینپیشرفتها "O’Farrell" درسال 1975 روش الکتروفورز دوبعدی را که برایجداسازی پروتئینهای "E.coli" بهینه شده بود، گزارش کرد. او در این روش ازایزوالکتروفوکوسینگ در ژلهای پلی آکریل آمید استوانه ای که حاوی 8% اوره و 2% "NP40" بود، در ترکیب با"SDS-PAGE" ناپیوسته ی"Laemmli" استفاده کرد.

ترکیب جداسازی بر پایه بارالکتریکی (نقطه ایزوالکتریک یا
pI) وجداسازیبراساس اندازه (جرم مولکولی نسبی یا Mr ) باعث می شود که پروتئین هاینمونه در پهنای ژلِ دوبعدی توزیع شوند. این شگرد اساس پیشرفت و تکاملالکتروفورز دوبعدی را در 30 سال بعدی تشکیل داد به طوری که تا کنون هزارانمقاله با استفاده از آن انتشار یافته است.

روشهای آماده سازی نمونه


قدم اول در آماده سازی نمونه, استخراج پروتئین ها از منبع مورد نظر است
. ممکن است استخراج پروتئین ها مستقیما" توسط بافر محلول سازی "Solubilization buffer" صورت پذیرد. ممکن است این عمل توسط روش هایمتلاشی ساختن سلولها "Cell disruption" و بافتها انجام شود و سپس پروتئینهای استخراج شده در بافر محلول سازی کاملا" حل شوند. برای استخراج کاملپروتئینهای داخل سلولی، سلول باید کاملا" متلاشی شود. انتخاب روش متلاشیسازی بستگی به این دارد که نمونه از چه منبع بیولوژیکی, از سلول, بافتجامد و یا از منابع دیگری, بدست آمده باشد. بعد از استخراج, این نمونه هاباید برای انجام الکتروفورز دوبعدی آماده شوند. منظور از آماده سازینمونه, محلول ساختن حداکثر پروتئین های موجود و حفظ حلالیت آنها در حینروند الکتروفورز دو بعدی است.

هیچ روش منفردی را نمی توان بصورت عمومی برای آماده سازی نمونه هایی که
توسط الکتروفورز دو بعدی مورد بررسی قرار می گیرند, معرفی کرد. در واقعماهیت متفاوت نمونه ها امکان بکار گیری روشی یکسان را در آماده ساختن آنهابرای الکتروفورز دو بعدی منتفی می سازد. از طرفی دیگر، روش بکار گرفته شدهدر هر تجربه ای به هدف طراحی شده نیز بستگی دارد. برای مثال, ممکن است هدفاز انجام الکتروفورز دوبعدی دستیابی به پروتئینهایی با ویژگی های خاص باشدیا ممکن است دستیابی به نقشه کامل از پروتینهای نمونه از اهمیت بیشتریبرخوردار باشد, در هر یک از این موارد استراتژی های انتخابی کاملا" متفاوتخواهند بود. در بهینه ساختن استراتژی آماده سازی نمونه باید از نتایجموردنظر, انتظاری مشخص داشت؛ باید برای ما مشخص باشد که نشان دادن نمونهبطور کامل مهمتر است یا بدست آوردن یک الگوی تکرارپذیر.

اضافه تر کردن مراحل آماده سازی نمونه می تواند کیفیت نتیجه نهایی را بهتر
کند, اما این امر به قیمت از دست دادن گروهی از پروتئینها تمام می شود. بههرحال, این تناقص و نسبت معکوس بین کیفیت نمونه بهبود یافته و نمونه سازیکامل پروتئینها باید کاملا"درنظر گرفته شود.

در هر صورت, خطوط راهنمای کلی برای آماده سازی نمونه وجود دارد که با پی
گیری آنها می توان قدمهای نخست را در این راه به درستی برداشت و سپس باتجربه بهترین نتیجه را بدست آورد.

مبانی الکتروفورز


الکتروفورز روشی است که در آن نمونه هایی که بار الکتریکی دارند، تحت
تأثیر یک میدان الکتریکی از میان شبکه ای متخلخل حرکت می کنند. سرعت حرکتمولکولها در این شرایط نه تنهاتحت تاثیر بار الکتریکی اشان است بلکهعواملی دیگری نظیر اندازه و شکل مولکول نیز در این امر دخیل هستند. بههمین دلیل الکتروفورز روشی مناسب و کارآمد در جداسازی مولکول مورد استفادهقرار می گیرد. معمولا" الکتروفورز برای جداسازی مولکولهای بزرگی چونپروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک به کار برده می شود, اما در مواردی نیز برایجداسازی مولکولهای باردار کوچکتری نظیر قندها, اسیدهای آمینه, پپتیدها وحتی یونهای ساده مورد استفاده قرار می گیرد.
معمولا" برای الکتروفورز یک مخلوط مولکولی, لایه نازکی از آن, بر روی شبکه
ای متخلخل که محلولی را درون خود محبوس کرده است, قرار داده می شود. پس ازبرقرای میدان الکتریکی با اِعمال اختلاف پتانسیل در دو سوی این شبکه, مولکولهای موجود در نمونه با سرعت های متفاوتی درون شبکه متخلخل شروع بهحرکت می کنند. این اختلاف سرعت مبنای جداسازی در الکتروفورز است. درپایان, مولکولهای پروتئینی مختلف به صورت باند هایی مجزا در قسمت هایمختلف شبکه آشکار می شوند. شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکولها دراثر گرمای ایجاد شده به خاطر جریان الکتریکی نقش مهمی دارد. علاوه بر ایندر مواردی که از ژل های آگاروز و پلی آکریل آمید استفاده می شود, شبکهمتخلخل نقش یک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکولها را نیز ایفا میکند.
در اغلب دستگا ه های الکتروفورز, ژل مابین دو محفظه ی بافری قرار می گیرد
به طوریکه ژل تنها واسطه در عبور جریان الکتریسیته بین این دو محفظه باشد


جداسازی توسط الکتروفورز تحت تاثیر عوامل متعددی قرار دارد. ماهیت
مولکولهای نمونه نظیر بار الکتریکی و اندازه آنها و شدت جریان و میدانالکتریکی و بالاخره اثرات محیطی نظیر نوع و نحوه ی استفاده از بافرها وحرارت ایجاد شده در حین کار عواملی هستند که بر نحوه ی جداسازی مولکولهاینمونه اثر می گذارند.

1-
اثر عوامل الکتریکی


در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول ها تناسب مستقیم با اختلاف پتانسیل اِعمال
شده دارد. قانون اُهم Ohm در الکتروفورز از اهمیت زیادی برخوردار است (معادله 1)
V=IR
معادله 1- قانون اهم؛
V ولتاژ یا اختلاف پتانسیل برحسب ولت, I شدت جریان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است

معادله فیزیکی دیگر که از آهمیت برخوردار است, معادله توان است. این معادله مقدار حرارت ایجاد شده در حین الکتروفورز را مشخص می کند
.

P=V2/R
یا
P=I2R یا P=VI
معادله 2- معادله توان که در آن
P توان بر حسب وات است.

این حرارت ایجاد شده بر اثر مقاومتی است که الکترودها, بافر مورد استفاده
, و ژل دارند و به گرمای ژولJoule heat موسوم است. منابع الکتریکی Power supply مورد استفاده در الکتروفورز ایجاد جریان مستقیم می کنند و معمولا" یکی از پارامترهای الکتریکی,یعنی یاجریان یا اختلاف پتاتسیل یا توان راثابت نگاه می دارند. باید توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده درالکتروفورز را به هر حال نمی توان ثابت نگاه داشت. برای مثال در حینالکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرمای ژول, کاهش می یابد. بنا بر نوع بافربکار رفته و پارامتر الکتریکی که ثابت نگاه داشته می شود, گرمای ژول درحین انجام الکتروفورز ممکن است کاهش یا افزایش یابد . برای مثال در "SDS-PAGE" ناپیوسته ثابت نگاه داشتن شدت جریان منجر به افزایش دما می شودکه نیاز به سیستم خنک کننده را در چنین وضعیتی الزامی می کند.


انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتریکی در حین الکتروفورز, با در نظر
گرفتن متغیر های مختلفی صورت می پذیرد. برای مثال مدت زمان مورد نظر برایانجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دستدادن فعالیت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ می دهد, و نیاز بهحفظ دمای خاص برای انجام الکتروفورز. معمولا" پروتئین ها با جریان ثابتالکتروفورز می شوند, در حالیکه الکتروفورز اسید های نوکلئیک با ولتاژ ثابتانجام می شود.

اثر سیستم های بافری و
pH

پروتئین ها به علت خصوصیت آمفوتری خود تحت تاثیر
pH محیطی که در آن قرارداشته باشند بارالکتریکی خاص خود را نشان می دهند. بدین ترتیب در جداسازیتوسط الکتروفورز باید pH محلول های مورد استفاده ثابت باقی بماند از آنجاکه الکترولیز آب در آنود یونهای "H+" و در کاتود یونهای "OH-" ایجاد میکند, برای ثابت نگاه داشتن pH محلولهای مورد استفاده, آنها باید بافرشوند.

2-
اثر حرارت


برای حفظ تکرار پذیری, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز
بسیار مهم است. برای مثال پلی مریزه شدن آکریل آمید یک واکنش گرمازا است, از اینرو گرمای ایجاد شده در حین پلی مریزاسیون, به خصوص در مورد ژل هایغلیظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بی نظمی در اندازه ی منافذ ژلگردد. انتقال گرما معمولا" مشکلی در ژل هایی با غلظت کمتر از 15% T نمیکند. به هر حال گرمای زیاد در حینالکتروفورز مشکلات دیگری را نیز پدید میآورد؛ شکستن شیشه های الکتروفورز, آسیب به دستگاه. وقتیکه حرارت بصورت یکدست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهای جدا شده نامنظم » شود و در اصطلاحباندها خندان می شوند چون نمونه ها در ردیف های وسط سریع تر از ردیف هایکناری حرکت خواهند کرد.

الکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید


اکثر روش های مربوط به تفکیک پروتئین ها که امروزه از آنها استفاده می شود
بر مبنای الکتروفورز منطقه ای یا ناپیوسته ژل های پلی آکریل آمید استواراست . الکتروفورز منطقه ای روی ژل پلی آکریل آمید تحت عنوان "PAGE" شناختهمی شود. در این روش از تفاوت وزن مولکولی و بارالکتریکی پروتئین ها به طورهمزمان برای تفکیک آنها از یکدیگر استفاده می شود.

اساس این روش بر مبنای حرکت مولکولهای باردار در یک میدان الکتریکی مشخص
است. مشخصات میدان الکتریکی نظیر اختلاف پتانسیل، فاصلة بین الکترودها ،مشخصات مولکول نظیر بار الکتریکی, اندازه و شکل مولکول ، و عوامل دیگرینظیر دما و زمان بر نحوه ی انجام این روش تاثیر می گذارند.

درسیستم ناپیوسته
"Laemmli" دو نوع ژل وجود دارد: ژل ردیف کننده و ژلتفکیک کننده Resolving ژل ردیف کننده ژلی با طول کم و با منافذ بزرگ استکه در بالای ژل بلند و با منافذ کوچک تفکیک کننده قرار می گیرد. در سیستم "Laemmli" ژلهای ردیف کننده و تفکیک کننده با تو جه به ترکیب بافریشان نیزناپیوسته اند.

این دو پارامتر ; بافرهای متفاوت و ترکیب آکریل آمید متفاوت به نمونه هایی
با حجم نسبتاً بزرگ این اجازه را می دهد که در بخش بالای ژل ردیف کنندهمتمرکز شوند پیش از آنکه بواسطة ورود به ژل پائینی تفکیک کننده عملجداسازی رویشان انجام گیرد.

مزیت مهم ژل ردیف کننده توانایی آن در تمرکز پروتئین نمونه های بسیار رقیق
است . این کار بطور مؤثری تفکیک مراحل بعدی را بهبود می بخشد چراکه نمونةاصلی در ناحیة خیلی باریک و بسیار متمرکزی جمع می شود و همة مولکولهایپروتئینی جداسازی الکتروفورتیک خود را تقریباً از یک نقطه شروع می کنند.

ردیف شدن ناشی از ایجاد یک گرادیان محدودو با ولتاژ بالا است که در آن
پروتئین ها مقید به یک ناحیة باریک کاملاً متمرکز بین یونهای کلرایدپیشتاز و گلایسین دنباله رو می شوند. وقتی جریان الکتریکی از نمونه عبورمی کند، یون کراید از سایر یونها که حرکت آرامتری دارند ( مثلاً گلایسین ) سریعتر مهاجرت می کند. یون های نمونه با حرکت حد واسط خود بین یونهایکلرید و گلایسین کمپرس شده و در نتیجه یک ناحیة باریک یا باندی شکل بسیارمتمرکز ایجاد می شود. بنابراین ژل ردیف کننده قادر است پروتئین ها رابصورت باندی باریک ساندویچ کند. برای انجام جداسازی الکتروفورتیک، پروتئینها بعد از انباشته شدن روی یکدیگر از آن محدوده جدا شوند. تفکیک بدون ردیفکردن و با با افزایش ناگهانی pH و کاهش قطرحفرات ژل نیز امکان پذیر است . تحت این شرایط ، یونهای نمونه به ژل تفکیک کننده مهاجرت کرده و یونهای عقبدنباله رو ( گلایسین ) متناوباً از یونهای نمونه پیشی گرفته و جلو میزنند. بنابراین گرادیان ولتاژ نسبتاً ثابتی ایجاد می شود که در آن جداسازیالکتروفورتیک نمونه رخ می دهد.

نحوه ی ایجاد منافذ با اندازه های متفاوت


ژل پلی آکریل آمید محدودة گسترده ای از اندازه های حفرات ژلی را دربر می گیرد
.


ژل پلی آکریل آمید با پلیمریزاسیون آکریل آمید مونومریک و مونومر ایجاد
کنندة پیوند متقاطع Cross linker, بیس آکریل آمید شکل می گیرند.


پلیمریزاسیون آکریل آمید و بیس آکریل آمید می تواند به صورت شیمیایی, با
تترامتیل اتیلن دیامین N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) وآمونیوم پرسولفات, یا سیستم فتوشیمیایی باشد.

رادیکالهای آزاد پرسولفات که با حل آمونیوم پرسولفات در آب ایجاد می شوند
مونومر آکریل آمید را فعال کرده و "TEMED" در این واکنش با انتقال الکتروناین واکنش را کاتالیز می کند . در عین حال ریبوفلاوین می تواند در حضوراکسیژن و اشعة UV رادیکال آزاد تولید کند . بعضی مواقع از ریبوفلاوین وآمونیوم پرسولفات برای ایجاد رادیکالهای آزاد استفاده می شود.

اندازة منافذ ژل عامل اصلی در تعیین قدرت تفکیک پروتئین ها و پلی پپتیدها
در ژلهای پلی آکریل آمید است. اندازه ی منافذ با دو پارامتر مشخص می شوند: محتوای کل ماده ی جامد یا %T ونسبت مونومر ایجاد کننده ی پیوند متقاطع بهمونومر آکریل آمید یا %C.


بدین ترتیب پلیمرهای آکریل آمید می توانند منافذی با اندازه های بسیار
متفاوتی را ایجاد کنند. با تغییر در غلظت آکریل آمید و نسبت اتصالاتمتقاطع کنترل اندازه ی منافذ امکان پذیر است. برای مثال، با افزایش نسبتپیوندهای متقاطع ، اندازه ی منافذ کاهش می یابد. انتخاب دقیق و درست غلظتژل آکریل آمید برای جداسازی بهینه پروتئین ها در الکتروفورز ضروریاست(جدول 5-2(.

محدوده اندازه ی مولکولی قابل تفکیک
(kD) درصد آکریل آمید در ژل
205-36 5%
205-24 5/7%
205-14 10%
66-14 12%
45-14 15%
جدول - در صد آکریل آمید برای جداساژط پروتئین هایی با اندازه های مختلف


نکات دیگری نیز در نحوه ی پلی مریزه شدن موثرند, برای مثال با افزایش دمای
پلیمریزاسیون، میزان پلیمریزاسیون افزایش می یابدو اندازه ی منافذ ژل کوچکمی شود. درحالیکه کاهش دمای پلیمریزاسیون می تواند ژلهایی با منافذ بزرگتولید کند. عواملی که کارایی تبدیل مونومر به پلی مر را تحت تأثیر قرار میدهند نیز می توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثیر قرار دهند. برای مثال ،استفاده از آکریل آمید کیفیت پائین و نیز pH بسیار بالا یا پایین سببتبدیل ناکامل مونومر به پلی مر شده و سبب ایجاد منافذ بزرگی در ژل شود. مواد افزودنی ژل نیز می تواند بطور قابل توجهی ساختار منافذ ژل را تحتتأثیر قرار دهدمثلاً اوره 8 مولار سبب ایجاد ژلهایی با منافذ کوچک می شود, چون سبب تسهیل پلیمریزاسیون کامل می شود.


مطالب مشابه :


الکتروفورز دو بعدی

الکتروفورز ژل در پروفایل نمودن پروتئین ها این دو روش ترکیب شده و الکتروفورز دوبعدی




پزوتئومیکس

الکتروفورز دو بعدی در تکنیک الکتروفورز دوبعدی، پروتئین ها در بعد اول با انجام ief




الکتروفورز دو بعدی چیست

این شگرد اساس پیشرفت و تکامل الکتروفورز دوبعدی را در 30 سال بعدی تشکیل داد به طوری که تا کنون




پروتئوم و پروتئومیک

الکتروفورز دوبعدی یکی از قویترین روشهای تفکیک پروتئینها است. در الکتروفورز دو بعدی، ابتدا




الکتروفورز دو بعدی چیست ؟

الکتروفورز دو بعدی چیست ؟ الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند




پروتئومیکس Proteomics

الکتروفورز دوبعدی-از




two-dimensional elechtrophoresis

همون طور که قبلا اشاره کردیم طی الکتروفورز 2 بعدی خوب اینم از پرونده الکتروفورز دوبعدی.




شاخه بندی شیمی تجزیه

Two dimensional electrophoresis الکتروفورز دوبعدی ۷-۴-۱-۱- Immunofixation electrophoresis الکتروفورز تحکیم ایمنی




برچسب :