PCR چيست ؟

PCR چيست ؟

عنوان مقاله: (PCR)Polymerase Chain Reaction واکنش زنجیره ای پلیمراز

PCRبه علت دارا بودن ویژگی وحساسیت بالا وسرعت وسهولت آن جایگاه ویژه ای درتحقیقات وتشخیصهای مولکولی پیدا کرده است.PCR درسال1983توسط دکترMullis ابداع شد،که جایزه نوبل شیمی رادرسال1993 دریافت کرد.

PCR در محیط آزمایشگاه(in vitro) امکان تکثیریک توالی معین ازDNAراکه بین دوتوالی مشخص قراردارد امکان پذیرمی کند تا DNA ازنظرمقدار به حدکافی برسد وبتوان روی آن آزمایشهایی مثل الکتروفورز-ژل آگارز- پلی اکریل آمید،هیبریداسیون باپروب راانجام داد.این روش ازنظرعلمی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد.دکترMullis اولین بار ازآنزیمDNA پلیمراز اشریشیا کولی برای انجام PCR استفاده کرد.

کاربردPCR

تعین جنسیت جنین،تعیین ژنوتیپ اپیتوپهای پیوندی ،تعیین ژنوتیپ گروههای خونیABO ،تهیه نسخه های متعدداز یک ژن،تشخیص بیماریها واختلالات ژنتیکی ،تشخیص بیماریهای عفونی ،ردابوت وتعیین والدین مطالعات باستان شناسی ،تعیین انواع لوسمیها ،تولیدوطراحی واکسنهای انسانی ودامی ،پزشکی قانونی وانگشت نگاری،DNA ازروی لکه خشک شده خون ،درتشخیص HIV ،سل وبیماریهای مقاربتی.

درحقییقت این تکنیک می رود تا دراینده نتیجه گیری دادگاهها راتحت تأثیرقراردهد.

دانشمندان اکنون می توانند میکروارگانیسمهای غیرقابل کشتی راکه تا کنون نمی توانستند با روشهای کلاسیک میکروب شناسی مورد مطالعه قراردهند به کمک PCR مطالعه نمایند .

نمونه های مورداستفاده برای آزمایشگاه مولکولیPCR

طیف وسیعی ازمواد بیولوژیک ،لکه های خون،سرم،بزاق،منی ،مو ،مایع نخاعی ،استخوان، مایع آمنیون،سلولهای خودجنین درمرحله بلاستولا ،نمونه های بیوپسی ویا آتوپسی باشند هرچه آلودگی کمترباشد حساسیت ودقت نتایج بیشتر خواهد بود.

اصول وروشهای PCR

روش PCRبرمبنای سه روش ساده بنا شده که انجام این سه مرحله درهرواکنش سنتز DNA ضرورت داردکه با برنامه دادن به Thermocycler اجرا می شود وعبارتند از:

1- مرحله Denaturation: دراین مرحله DNA هدف براثرحرارت تک رشته ای می شود،حرارت90-95 درجه سانتیگراد

2- مرحله Annealing : دراین مرحله با کاهش حرارت سیستم ،پرایمرها درمحل مناسب روی رشته مکمل متصل می شوند ،دما53-75 درجه سانتیگراد، درمرحله Anneling بایددقت لازم بعمل آیدودما باید به درستی انتخاب شود این کار توسط کامپیوتر به طور مستقیم ویا توسط محقق وبا توجه به دانش فنی وتجربه صورت می گیرد اگردمای Annealing بدرستی انتخاب نشود احتمال تکثیر غیراختصاصی DNAوجوددارد به طوری که دردمای پایینتراز حداستانداردAmplication غیراختصاصی ودر دمای بالاتر ازمعمول عدم تکثیرDNA دخ می دهد.

3 – مرحله Extension : در این مرحله که دمای آن برای انزیم DNA پلیمراز مطلوب می باشد موجب توسعه پرایمرها شده وهمانندسازی DNA هدف انجام می گیرد.دما حدود72 درجه سانتیگراد آنزیم مقاوم به حرارت Taq polymerase چهارتا نوکلئوتید dATP ، dGTP ،dTTP، dCTP موجود درمحیط وبافرهای PCR شامل Tris وپرایمرهای جفت شده به DNA را درحضورMgcl2 مورداستفاده قرار می دهد و واکنش پلیمریزاسیون را کاتالیز می نماید وسبب طویل شدن رشته DNA جدیدی که توسط پرایمر ساخته شده است می شود .

نتیجه چرخه سه مرحله ای فوق سنتز دو مولکول جدیدDNA است ،سنتز DNA جدید به صورت تصاعدی آنقدر ادامه می یابد تا اینکه یکی ازمواد تشکیل دهنده محیط واکنش کاهش یابد وغیرفعال شود. به طورکلی حدود35-25 سیکل کافی است تا ازمقدار بسیارکم DNA صدها هزارنسخه DNA سنتز گردد. ازنظرتئوری بعداز20 سیکل 1میلیون وبعداز 30سیکل 1میلیارد کپی حاصل می گردد.نکته ای که درمراحل مختلف PCR بایدمورد توجه قرارگیرد زمان لازم برای رسیدن ازیک دما به یک دمای دیگرکه زمان کوتاهی است (Ramping Time).

پارامترهای مؤثر در PCR :

1- زمان ودمای Denaturation بستگی به تعداد C و G دارد

2- دمای Annealing پرایمرها که باید4-3درجه کمترازدمای ذوب پرایمرها باشد

3- زمان Primer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد

4- تعداد سیکلها

5- Ramp (زمانی که طول می کشد تا دمای مبدادستگاه به دمای مقصد برسد)هرچه این زمان کمترباشد نتیجه کاربهتراست و واکنش زمان کمتری دردمای ناخواسته قرار می گیرد

6- غلظت dNTP ها ویون منیزیوم(اینها مجموعه ای راتشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز می شوند وغلظت این دوماده تابعی ازیکدیگر می باشند)

7- غلظت Template DNA (یک دهم تایک میکروگرم می باشد)چنانچه DNA هدف به صورت مالتی کپی درژنوم باشد بهتراست

8- اضافه کردن تشدیدکننده های PCR

9- حذف مهارکننده های آنزیم ازمحیط

10- بهتراست نقطه ذوب پرایمرها شبیه هم باشد(Tm یکسان داشته باشند)

طراحی پرایمر:

پرایمرهای PCR به صورت کاملاً اختصاصی ومکمل ناحیه مورد نظرDNA هدف طراحی میگردند.پرایمرها 30-20باز دارندوپرایمرهای بیش از30بازاختصاصیت خوبی ندارند.همچنین پرایمرها بایددمای انیلینگ بالا داشته باشند.بهتراست تعدادبازهای دو پرایمر مساوی باشند واز پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند،همچنین نواحی تکرارشونده نداشته باشندچنانچه بازهای GیاC به صورت تکراری وپشت سرهم باشند پرایمربه صورت لوپ در می آید وعملاًسیستم کارنمی کند.نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام می دهند.بعداز طراحی پرایمربهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blast انها را چک نمود تامشخص شود که با چه ژنهای دیگر می توانند Anneal گردند.

استخراجDNA ازخون:

1- مقدار100 میکرولیتر خون (خون لخته نشده باشد - برای کارهای PCR ازEDTA بعنوان ضدانعقاد استفاده شود زیرا مواد ضدانعقاد دیگر مهارکننده آنزیم پلیمراز میباشند)

2- مقدار 700 میکرولیترDNG ( ماده ای برای استخراج DNA که به مدت 20 دقیقه در دمای 37درجه که این ماده معرف اصلی کیت می باشد )اضافه می کنیم

3- به مدت 15ثانیه آن را ورتکس می کنیم

4- به مدت 5دقیقه در دور 3000 سانتریفیوژ می کنیم

5- سپس خون را از میکروتیوب به میکروتیوب دیگر انتقال می دهیم بدون اینکه لخته ها وارد شود

6- به داخل خون 500 میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه می کنیم سپس تکان می دهیم تا هاله سفیدرنگی تشکیل شود

7- درفریز 20- درجه به مدت 20 دقیقه قرار می دهیم

8- بعد از فریز به مدت10 دقیقه در دور13000 سانتریفیوژ می کنیم

9- محلول رویی را دور ریخته وبه لکه پایین cc1 اتانل 75درصد اضافه می کنیم

10- مقدار5-2 میکرولیتر آن را برای واکنش PCR استفاده می کنیم

استخراج DNA ازبافت:

1 - مقدار100 میلی گرم بافت توسط ازت مایع پودر می کنیم (به بافت ازت مایع اضافه می کنیم و

بوسیله هاون به هم می زنیم) واز این 100 میکرولیتر بر می داریم وداخل میکروتیوب می ریزیم

2 - 400 میکرولیتر DNG به بافت اضافه می کنیم

3- به مدت 15 ثانیه ورتکس می کنیم

4- 300 میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه می کنیم

5- یک لایه شیری رنگ تشکیل می شود که DNA است به مدت 20 دقیقه داخل فریزر 20- قرار می دهیم

بایدها ونبایدها در PCR :

1- آزمایش باید در محلی بدون رفت و آمد انجام گیرد

2- سمپلرهای مورد استفاده نباید برای کارهای دیگر استفاده شوند ،ظروف لوله ها وسرسمپلرها اتوکلاو شوند وهنگام کار از دستکش استفاده شود( برای ممانعت ازعمل آنزیم DNase که سبب تخریب DNA هنگام استخراج DNA می شود وممانعت از عمل آنزیم RNase که سبب تخریب RNAهنگام استخراج RNA می شود) چون این دو آنزیم در محیط کار ودستها زیاد است

3- هنگام تهیه واکنش نمونه کنترل مثبت را آخر کارتهیه کنید

4- اعمال قبل وبعد PCR جدا از همدیگر انجام گیرد

5- برای استفاده از هرماده از پیپت جداگانه واختصاصی استفاده کنید

6- هنگام استفاده هرلوله را spin کنید تاموادی که به اطراف درب لوله چسبیده اند جدا شده ورسوب کنند

7- چندین کنترل منفی حین آزمایش Runکنید

8- برای انجام آزمایشهای تاییدی از مواد فریز شده استفاده کنید

9- همیشه DNA آمپلی فای شده راخارج از محل آماده کردن نمونه نگهداری کنید

10- هنگام کار باPCR product مقداری از آن را جداگانه نگهدارید

موادی که برای PCR لازم است :

1- بافرPCR - x10 (PCRدرحجم 25یا50 میکرولیترانجام می گیرد برای حجم 25 میکرولیتر 2.5میکرولیتربافرنیاز است

2- DNTP(نوکلئوتیدها)0.5میکرولیتر

3- Mgcl2 1 میکرولیتر

4- پرایمررفت 1 میکرولیتر

5- پرایمر برگشت 1 میکرولیتر

6- DNA 1 میکرولیتر

7- آنزیم 0.2 میکرولیتر

8- آب مقطر 17.8 میکرولیتر(مجموع مواد بالا منهای 25 می شود 17.8 که آب است)

بعد از ریختن مواد بالا در لوله های مخصوص PCR لوله ها را داخل Block دستگاه ترموسایکلر قرار دهید ودستگاه را روشن کنید (مقدار 100 میکرولیتر روغن معدنی روی واکنش بریزید تا از بخار شدن مواد ممانعت بعمل آورد.لازم به ذکر است که دستگاههای ترموسایکلرجدید به صورت Heated lid ساخته شده اند یعنی درب دستگاه که روی لوله های واکنش قرار میگیرد حدود 105 درجه گرم میشود در نتیجه بالای لوله گرمتر از پایین آن است واز بخار شدن مواد داخل لوله جلوگیری می شود ) پس از اتمام کار محصول آمپلی فای شده را با اگارز 3درصد الکتروفورز کنید.

منابع ومأخذ:

مبانی مهندسی ژنتیک نوشته M.T.Davson (GENE Technology )
WWW.protocol-online.org
ماهنامه TASHKhIS AZmayeshgahi (laboratory diagnosis)
William.ceccarelli,A.andspurr,N.(1993) Genetic engineering.

PCR چيست ؟

مطالب مشابه :

استخدام میکروبیولوژی-بیوتکنولوژی-علوم سلولی مولکولی-ژنتیک

آگهی استخدام کارشناس ژنتیک یا آزمایشگاه

استخدام

استخدام

استخدامی در بانک کشاورزی

بازار کار و استخدام رشته های میکروبیولوژی.ژنتیک.بیوشیمی.بیوتکنولوژی و زیست شناسی

فارغ‌التحصیلان رشته میکروبیولوژی چه کار می کنند؟؟

آگهی استخدام دانشگاه شهرکرد-مهلت: 17 دی 92

PCR چيست ؟

بازار کار و استخدام رشته های میکروبیولوژی.ژنتیک.بیوشیمی.بیوتکنولوژی و زیست شناسی