اسپکتروفتومتری

روش اسپکتروفتومتری یکی از روش های طیف سنجی (spectroscopy) می باشد که در آن از طول موج های ماورای بنفش (UV) و مرئی طیف الکترومغناطیسی برای بررسی کیفی و اندازه گیری کمی مولکول ها و ترکیبات در آزمایشگاه های تحقیقاتی و بالینی استفاده می شود.

اساس روش اسپکتروفتومتری این است که هر مولکول و ترکیب ویژه در محلول شفاف، یکی از طول موج های نور را بیشتر از سایر طول موج ها جذب می کند که این طول موج λm (لاندای ماکسیمم) نام دارد.اگر یک طول موج از نور (λm) از محلول شفافی با شدت I0 عبور کند ، بخشی از نور توسط محلول جذب می شود و بقیه با شدت کمتر (I) از محلول عبور میکند.

دستگاه اسپکتروفتومتری، شدت نور جذب شده توسط محلول را اندازه گیری می کند

اجزای یک دستگاه اسپکتروفتومتری معمولی عبارتند از :

1-منبع نور که کلیه طول موج های نور مرئی و UV را از خود ساتع می کند.

2-مونو کروماتور (تک فام ساز) که یک طول موج خاصی (λm) را از خود عبور می دهد.

3-جایگاه قرار دادن نمونه که در لوله های مخصوص دستگاه به نام کُوِت (Cuvette) که طولی برابر 1cm دارند ریخته می شود

4-detector که یک فتوسل( نور سنج ) است که نور عبوری از محلول را اندازه گیری می کند

جذب نور توسط محلول ها از قانون بیر-لامبرت (Beer-Lambert) پیروی می کند. طبق این قانون مقدار نور جذب شده توسط یک محلول شفاف با غلظت ماده ی مورد نظر (C) و مسافتی که نور در محلول طی می کند (قطر کوت= 1CM) ارتباط مستقیم دارد.

-دانسیته ی نوری (Optical density→OD یا Absorbance→ A) به مقدار نور جذب شده توسط محلول است که بدون واحد می باشد.

- (ε←اپسیلون) ضریب جذب مولی یا ضریب خاموشی می باشد که واحد آن mol-1.cm.L می باشد

-(C) غلظت ماده ی مورد نظر با واحد mol/L می باشد.

-(L) مسافتی که نور در محلول طی می کند (قطر کوت) می باشد که 1cm است.

روش های محاسبه ی غلظت :

1: محاسبه ی غلظت از روی ضریب خاموشی:

اگر ضریب خاموشی (ε) برای ماده ی مورد نظر مشخص باشد می توان با اندازه گیری میزان جذب نور توسط محلول، غلظت آن را محاسبه کرد

A=εLC → C=A/εL→ L=1cm → C=A/ε

2- محاسبه ی غلظت با استفاده از یک محلول استانداد:

در این روش یک محلول از ماده ی مورد نظر با غلظت مشخص تهیه می گردد که محلول استاندارد نام دارد و با اندازه گیری جذب محلول استاندارد و محلول مجهول و مقایسه ی جذب این دو محلول،میتوان غلظت محلول مجهول را محاسبه کرد.

A=εLCمجهول

A Cاستاندارد/Cامجهول→ استاندارد /Aمجهول →εL برای هردو محلول یکسان است پس حذف می شوند.

A=εLCاستاندارد

Cاستاندارد×استانداردA/Aمجهول =Cمجهول

3-با استفاده از منحنی استاندارد:

مانند روش دوم است با این تفاوت که چند غلظت از محلول استاندارد تهیه می کنیم، روی محور می بریم (غلظت=OD=X ,Y)، یک منجنی استاندارد می کشیم و مجهول را با استفاده از آن منحنی پیدا میکنیم.دقت کنید که همیشه منحنی خط راست نیست و بعضی وقتها به شکل لوگاریتمی است. (کاغذ شطرنجی یعنی مثلا روی محور X دمای گزارش شده را می نویسیم و روی محور Y دماهای گزارش شده را و بعد از رسم منحنی از روی محور Y به سمت منحنی خط می کشیم و وقتی به منحنی رسیدیم از آن نقطه به محور X عمود می کنیم و دمای مجهول که مشاهده کدیم را روی نمونه پیدا می کنیم که این دما همان گزارشش شده است.در اینجا هم همین طور عمل می کنیم.)

(دما در رابطه با اندازه گیری آنزیم هست که به ازای هر درجه تغییر 7% خطا در جواب خواهیم داشت. اگر فقط بخواهیم غلظت رو بدست بیاریم و فقط OD رو بخونیم نیازی به دما نیست)

نکته:

قبل از اندازه گیری جذب محلول مجهول یا استاندارد باید جذب دستگاه توسط محلولی به نام محلول بلانک، صفر شود.محلول بلانک محلولی است که از نظر داشتن تمام ترکیبات به جز ماده ی مورد نظر همانند استاندارد یا مجهول است.به این ترتیب، جذب سایر اجزای موجود در محلول به جز ماده ی مورد نظر حذف می شود.

روش آزمایش:

اندازه گیری جذب محلول نیترات کبالت 5% (λmبرای محلول نیترات کبالت 520nm می باشد.)

1-ابتدا دستگاه اسپکتوفتومتر را روشن کنید و طول موج دستگاه را روی 520nm تنظیم کنید.

2-کوت دستگاه را از آب مقطر (به عنوان بلانک) پر کرده و پس از تمیز کردن توسط دستمال کاغذی در جایگاه خود قرار دهید و جذب آن را صفر کنید.

3- کوت را تخلیه کنید و محلول استاندارد نیترات کبالت با غلظت 5% را درون آن ریخته و جذب آن را اندازه گیری کنید.

4-کوت را تخلیه کرده و محلول نیترات کبالت با غلظت مجهول را درون آن بریزید و جذب آن را اندازه گیری کنید.

5-با توجه به فرمول ارایه شده، غلظت محلول مجهول را محاسبه کنید.

نکته:

وقتی محلول را داخل دستگاه گذاشتید و درب آن را بستید، دستگاه سریعا میزان جذب را نمایش می دهد بدون اینکه کاری بکنید و لازم به زدن دکمه یا چیز دیگری نیست.

سوال:

با توجه به غلظت روغن امگا3 امکان بدست آوردن لاندای ماکس وجود دارد؟ و چطور می شود غلظت این روغن را با توجه به عدم حلالیت روغن در اتانل و جمع شدن روغن ته کوت بدست آورد؟

جواب: لاندای روغن را به تنهایی می شود با دستگاه اسپکتروفتومتر بدست آورد. ولی لانداگیری روغن با اتانل امکان پذیر نیست و به چای آن می توان از کلروفرم یا بلک کلروفرم استفاده کرد

اسپکتروفتومتری

مطالب مشابه :

اسپکتروفتومتری

کنترل کیفی و کالیبراسیون لوپ میکروب شناسی

اندازه گیری آهن

کنترل کیفی و کالیبراسیون لوپ میکروب شناسی

اندازه گيري مقدار نیترات در آب به روش اسپکتروفتومتری

کنترل کیفی و کالیبراسیون لوپ میکروب شناسی

اسپكتروفتومتري

اندازه گيري فسفر خاك به روش اولسن( خاك هاي خنثي و قليايي) و بری (خاک های اسیدی) - فردوس عادلی مسبب