کشت سلول

کشت سلول چیست ؟

کشت سلول به فرایند کشت کنترل شده سلول‌های پروکاریوتی یا یوکاریوتی در محیط کشت، بکار می‌رود. این اصطلاح بیشتر در مورد کشت سلول‌های جانوران پر سلولی کاربرد دارد. برای کشت سلول‌های جانوری از محیط کشت‌های خاصی استفاده می‌شود. معمولا سلول‌های جانوری را در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و در انکوباتور‌های CO2 دار کشت می‌دهند. کشت سلول‌های جانوری باید در شرایط کاملا آسپتیک انجام شود. چون رشد سلول‌های جانوری بسیار کند تر از رشد باکتری‌ها و مخمرها است و امکان آلودگی وجود دارد. برای جلوگیری از رشد باکتری‌ها گاهی از آنتی بیوتیک‌هایی مانند پنیسیلین، استرپتومایسین و یا جنتامایسین استفاده می‌شود. محیط‌های کشت اختصاصی برای رشد سلول‌های مشخص نیز وجود دارد. مانند محیط کشتی که در آن فقط هپاتوسیت‌ها رشد می‌کنند و یا محیط کشت‌هایی که فقط نورون‌ها که تقسیم نمی‌شوند، می‌توانند زنده بمانند. برای اینکه سلول‌ها در محیط کشت بخوبی تکثیر یابند، لازم است تراکم آنه در محیط کشت کم باشد. برای این منظور باید هر چند وقت یکبار، سلول‌ها را به محیط کشت‌های تازه پاساژ داد. در صورتیکه تراکم سلول‌ها بالا رود، بعلت ممانعت تماسی تکثیر سلول‌ها متوقف شده و سلول‌ها وارد مرحله تمایز می‌شوند.

سلول‌ها از نظر نحوه کشت یافتن در محیط کشت به دو دسته تقسیم می‌شوند:

۱- سلول‌های وابسته به بستر (Anchorage dependent): این سلول‌ها برای اینکه بتوانند تکثیر شوند، باید به سطحی متصل شده باشند. این سلول‌ها بر روی محیط کشت آنقدر تکثیر می‌شوند تا بصورت تک لایه، تمام سطح محیط کشت را فرا گیرند. پس از آن بعلت اثر فرایند ممانعت تماسی تکثیر سلول‌ها، متوقف می‌شود. سلول‌های ترانسفوم شده بعلت اینکه پروتئین‌های سطحی خود (که در ممانعت تماسی نقش دارند) را از دست داده‌اند، می‌توانند بصورت چند لایه رشد کنند.

برای کشت سلول‌های وابسته به بستر، به بسترهای خاصی نیاز است. شیشه بعلت دارا بودن بار منفی بهترین سطح برای اتصال سلول‌ها است. از سطوح پلاستیکی (دارای بار مثبت)، در صورتیکه بکمک اشعه‌های یونیزه کننده، بار زدایی شوند نیز می‌توان استفاده کرد. سلول‌ها بکمک پروتئین‌های سطحی خود مانند: اینتگرین‌ها، فیبرونکتین، کلاژن و لامینین به این سطوح متصل می‌شوند.

سلول‌های وابسته به بستر را همچنین می‌توان بر روی سطوح معلق کشت داد. برای این منظور گاهی از گلوله‌های کلاژن، پلی استایرن، سفادکس، ژلاتین و یا پلی اکریل آمید، بعنوان سطحی برای اتصال سلول‌ها استفاده می‌شود.این گلوله‌ها در محیط کشت مایع معلق می‌شوند.

برای اینکه سلول‌ها بهتر به سطوح متصل شوند، می‌توان این سطوح را با کلاژن، فیبرونکتین، پرونکتین، انتاکتین، هپاران سولفات و.. پوشاند. همچنین می‌توان برای رشد اختصاصی سلول‌ها از مواد خاصی استفاده کرد. برای مثال برای رشد اختصاصی کوندروسیت‌ها از کوندرونکتین استفاده می‌شود.

۲- سلول‌های غیروابسته به بستر (Anchorage Independent): این سلول‌ها برای تکثیرو زنده ماندن لازم نیست قبلا به سطحی متصل شده باشند.مانند سلول‌های بنیادی هپاتوسیتی و یا رده‌های سلولی ترانسفورم شده.

کشت سلولی (شرح کار به صورت مقدماتی)

در ابتدا سلول های یخ زده و فریز شده داریم که در محفظه های لوله ای شکل خاصی که با یک فویل آلومینیومی نیز پوشانده شده اند، نگهداری می شوند. پس در مرحله ی اول باید سلول ها را دفریز کنیم تا یخشان باز شود و آماده ی کشت دادن شوند. سلول ها در نیتروژن مایع که دمایی بالغ بر منفی صد و نود شش درجه ی سانتی گراد دارد فریز می گردند. DMSO باید از محیط سلول ها بیرون بیاید و ما نیاز به سلول هایی با دمای طبیعی یعنی سی و هفت درجه ی سانتی گراد داریم. در کل دمای مناسب برای رشدسلول همان دمای محیط داخلی بدن انسان است. بهتر است مرحله به مرحله سلول ها را از حالت فریز در بیاوریم چراکه اگر به صورت ناگهانی این کار را بکنیم بهشان شوک وارد می شود و ممکن است کلا از بین بروند. برای دفریز کردن سلول ها از بن ماری یا انکوباتور استفاده می شود. بن ماری نوعی حمام آب گرم است. پس از مرحله ی بن ماری و یا انکوباتور، سلول ها در حالت سانتریفیوژ، آرام آرام از یخ زدگی در می آیند و در واقع از خواب بلند می شوند! اتاق کشت و کلا محیط کشت سلول باید دارای استانداردهای خاصی باشد و شدیدا باید از نظر پاکیزگی و ضدعفونی بودن مورد مراقبت قرار گیرد. یکی از چالش ها و مسائل بسیار مهم در کشت سلول ها استاندارد پاکیزگی آزمایشگاه کشت است. چرا که سلول ها به کوچکترین آلودگی حساس هستند. پس فرد کشت دهنده ی سلول باید کاملا پوشیده باشد تا عوامل تخریب سلولی را به محیط کشت سلول منتقل نکند. نکته ی مهم هود و فضای اطراف هود است که باید استریل شده باشد چرا که کشت سلول زیر فضای هود انجام می گیرید. و آن فضا بیشترین تماس را با سلول خواهند داشت. تمام وسایل زیر هود باید اتوکلاو شده باشند. نیم ساعت قبل از کار تا نیم ساعت پس از کار باید لامپ یو وی داخل آزمایشگاه مهندسی بافت روشن باشد تا محیط از برخی عوامل میکروبی پاک شوند. اتوکلاو نباید در فضای داخلی آزمایشگاه بافت باشد چرا که بخار بیرون آمده از آن سبب آلودگی محیط آزمایشگاه مهندسی بافت می گردد. برای همین است که اتوکلاو در بیرون آزمایشگاه و دور از محیط کشت قرار دارد. برخی از وسایل و مواد هستند که نمی توان آنها را اتوکلاو کرد برای آنها از روش فیلتراسیون یا همان فیلتر کردن استفاده خواهیم کرد. ست فیلتراسیون در واقع همان قیف، کاغذ فیلتر، ارلن و خروجی خلا است که پس از ست آپ، از آن استفاده می کنیم. برخی فیلتر ها سر سرنگی هستند که در واقع سر یک سرنگ نصب می شوند و موادی که از سر سرنگ با فشار عبور داده می شوند کم کم فیلتر می شوند. استریل کردن دست ها و کل مواد زیر هود با الکل هفتاد درصد از دیگر نکات مهم کار با سلول ها می باشد. در واقع پاک کننده ی محیط کشت الکل است. سرنگ را باز کرده و از مدیا (محلول قرمز رنگ) پر می کنیم سر سرنگ را به آن وصل می کنیم. کمی به صورت عمودی نگاه می داریم تا هوای سر سرنگ تخلیه گردد. فالکن را به سر سرنگ وصل می کنیم و به آرامی و به دقت مدیا را فیلتر می کنیم. معمولا فیلترها یک بار مصرف هستند و پس از هر بار مصرف out می شوند. سمپلر را با الکل کاملا تمیز می کنیم. این وسیله برای انتقال دادن حجم های مشخص به کار برده می شود. خود سمپلر و سر سمپلر با رنگ های استاندارد مشخصی دسته بندی شده اند که هر رنگ معرف حجم خاص و کاربرد خاصی است. مثلا رنگ زرد برای انتقال 10 تا 100 میلی لیتر کاربرد دارد. حال به بحث روی سلول هایمان می پردازیم. سلول های CHO رفتاری شبیه به سلول های فیبروبلاست دارند. سلول های فیبروبلاست، فراوانترین سلول بافت همبند است که همه انواع رشته‌های بافت همبند و مواد آلی ماده زمینه‌ای را سنتز می‌کند. فیبروبلاست، سلولی است با هسته بیضوی و روشن و دارای کروماتین ظریف است که حاوی یک یا دو هستک واضح می‌باشد. اندامک‌های دخیل در پروتئین سازی در فیبروبلاست بطور گسترده دیده می‌شوند. در مواردی که فعالیت سلول کاهش می‌یابد، اندازه سلول کوچک‌تر شده و هسته آن پر رنگ و دوکی دیده می‌شود که در این حالت فیبروسیت نیز می‌نامند. فیبروسیت‌ها درصورت تحریک قابل برگشت به حال فعال می‌باشند. در بیشتر آزمایش های کشت سلول از سلول های فیبروبلاست استفاده می گردد. سلول های CHO از سلول های تخمدان موش چینی گرفته می شود. به وسیله ی سل اسکرپر، سلول های باقیماند در ته فلاسک را تراش می دهند. پس از دفریز کردن سلول ها، آنها را به وسیله ی سمپلر داخل فالکون ریخته و بلافاصله سانتریفیوژ می کنیم. فلاسک ها باید زیر هود و در محیط کشت باز شوند تا آلودگی داخل فلاسک نگردد. پس از سانتریفیوژ کردن مایع رویی را خالی می کنیم. تا سلول ته نشین شده را به راحتی ببینیم! خالی کردن مایع رویی به وسیله ی سمپلر انجام می گردد. حالا سلول ها را پیپیتاژ می کنیم در واقع به وسیله ی سمپلر آنها را از هم باز می کنیم و به هم می زنیم. بهتر است ابتدا سلول ها را شمرد تا بدانیم در هر فلاسک چند سلول می ریزیم. بهتر است فلاسک هایمان فیلتر دار باشدو در غیر این صورت مجبوریم سر فلاسک را کمی باز بگذاریم تا سلول ها خفه نشوند. در هر فلاسک کلا پنج میلی لیتر وارد می کنیم که چهار و نیم میلی لیتر از آن محیط کشت است پنج صدم میلی لیتر از آن آنتی بیوتیک است و چهل و پنج صدم میلی لیتر از آن سرم FBS است. آنتی بیوتیک را برای این اضافه می کنیم که عوامل میکروبی و باکتریایی از محیط تخلیه گردند. از آنجایی که فلاسک مورد استفاده در آزمایش ما فیلتر دار نبود درش را کمی باز می گذاریم تا سلول های کشت شده ی ما خفه نشوند چرا که سلول دی اکسید کربن تولید می کند و این گاز باید به گونه ای از محیط تنفس سلولی خارج گردد. برای اینکه سلول ها خوب توزیع شوند فلاسک را کمی تکان می دهیم. و آنها را داخل انکوباتور با دمای سی و هفت درجه و استاندارد های لازم قرار می دهیم. در این مرحله کار ابتدایی ما تمام شده است و باید سلول ها را به حال خود بگذاریم تا رشد کنند. حال باید در انتظار رشد سلول ها بنشینیم تا در مراحل بعدی آنها را پاساژ دهیم.

48 ساعت بعد به سلول ها سر می زنیم. سلول ها را از انکوباتور در می آوریم. ابتدا سرنگ را باز می کنیم. باید از یک سرنگ بزرگ استفاده کنیم. با استفاده از سرنگ مدیا را می کشیم. سلول ها هم بزرگتر می شوند و هم کشیده تر می شوند. فیلتر را به سر سرنگ وصل می کنیم. حال مدیا را به آرامی فیلترمی کنیم و درون فالکن می ریزیم. در واقع وقتی مدیا از فیلتر با فشار عبور می کند فیلتر خواهد شد. سلول هایی که خیلی ریزند و یا اینکه روی سطح ایستاده اند در واقع مرده اند. همان طور که اشاره شد سلول هایی زنده مانده اند که حالت خودشان را حفظ کرده و کشیده تر شده اند. مقدار کمی از سلول های مرده در محیط کشت تاثیری روی سلول های زنده ی دیگر ندارد ولی اگر تعدادشان از یک حدی زیاد تر گردد مشکل ساز می گردند. حال سرم، مدیا و آنتی بیوتیک را به محیط جدیدمان اضافه می کنیم. با همان نسبت هایی که قبلا بهشان اشاره شد. محیط قبلی تغییر رنگ داده است. و از سرخ براق به زرد می گراید چرا که سلول ها مواد داخل محیط را مصرف می کنند. پس از خالی کردن محیط قدیمی کشت آن را با PBS دو سه دفعه شستشو می دهیم. حال محیط جدیدمان را اضافه می کنیم. ابتدا باید با میکروسکوپ چک کنیم که اصلا حد سلول ها به میزانی رسیده که پاساژشان دهیم یا نه. و در واقع یک شمارش سلولی خیلی تقریبی و ساده زیر میکروسکوپ توسط سل کانتر انجام می دهیم. سلول های زنده عموما به محیط می چسبند و سلول های مرده معلق خواهند ماند. فلاسک را با PBS شستشو می دهیم تا اگر احیانا سلول مرده ای مانده باشد شستشو داده شود. سلول های کف فلاسک هنوز کنده نشده اند! سعی می کنیم فشار PBS به آنها آسیب وارد نکند. حال نوبت اضافه کرده تریپسین به محیط است. تریپسین در واقع برای سلول یک ماده ی خطرناک به شمار می رود. حدود یک میلی لیتر از تریپسین به محیط اضافه می کنیم. در واقع ما از این آنزیم به عنوان عاملی برای کندن سلول ها از محیط قبلی استفاده می کنیم. منتها باید سعی کنیم که سلول زیاد در معرض تریپسین قرار نگیرد چون قطعا می میرد. پس از مدت زمان خاصی که سلول ها از کف فلاسک کنده شدند حال سرم را به محیط اضافه می کنیم تا اثر تریپسین را خنثی کند. سلول ها در این مرحله باید گرد و شناور در سرم باشند. اگر هنوز هم سلولی به کف فلاسک چسبیده با چند ضربه و تکان آرام سعی می کنیم آن را از کف بکنیم در غیر این صورت از ابزار میله ای شکل مخصوص به این کار استفاده می کنیم تا تمامی سلول ها در محیط سرم شناور گردند. به ازای هر میلی لیتر 300 تا 400 میلی لیتر سرم FBS اضافه می کنیم. حالا محتویات را داخل یک فالکن جدید می ریزیم. و دوباره سانتریفیوژ می کنیم تا سلول ها جداسازی شوند. در این فاصله محیط را آماده سازی می کنیم و سرم را در محیط می ریزیم. محیط قبل را داخل فلاسک خالی می کنیم. مجموع تریپسین و سرم را از سلول ها جداسازی می کنیم. حال دو میلی لیتر از محیط را به سلول ها اضافه می کنیم تا بتوانیم آنها را به راحتی برداریم. سلول ها را پیپتاژ می کنیم که دیگر سلولی در محیط قبلی ما نمانده باشد. برای شمارش تعداد سلول ها از صفحه ی شطرنجی شکلی زیر میکروسکوپ بهره می گیریم. این صفحه ی شطرنجی دارای چهار خانه ی بزرگ در گوشه هایش است. سلول های درون این چهار خانه را می شماریم و مجموع آنها را تقسیم بر چهار می کنیم تا میانگین بدست آید. حال آنها را ضربدر مقدار میلی لیتر موجود در محیط کشت می کنیم که پانصد میلی لیتر است و سپس ضربدر ده هزار یا ده به توان چهار می کنیم( یک عدد نرمالایز شده است) و سپس عدد حاصل را به عنوان تعداد سلول های موجود در محیط کشت گزارش می کنیم. برای شمارش سلولی از تریپان بلو استفاده می کنیم. تریپان بلو یک آنزیم سمی است که سلول کشته را از زنده تشخیص می دهد چرا که رنگ آمیزی آن به صورتی است که سلول مرده را از زنده متمایز می سازد. در واقع تریپان بلو ماده ای است که سلول های ما را رنگ آمیزی می کند. فقط باید حواسمان جمع باشد که شمارش را زیر میکروسکوپ سریع انجام دهیم چرا که تریپان بلو ماده ای سمی است و ممکن است پس از گذشت چند دقیقه سلول های زنده ی ما را نیز بکشد! محلول باید قبل از شمارش کاملا یکنواخت گردد و باید به حجم های مساوی و کم از دو فلاسک برداشته شود(حدود یک قطره که معادل 20 میکرو لیتر است). حال محیط کشت و سرم و آنتی بیوتیک را به نسبت های گفته شده به در فلاسک های مجزا می ریزیم. در حال حاضر یک فلاسک سلولی ما تبدیل شده به دو فلاسک سلولی و به این کار پاساژ دادن می گوییم. پس از چند مرحله پاساژ دادن می توانیم از سلولهایمان در آزمایش های مختلف از جمله آزمایش های تست های بیومتریال استفاده کنیم.

منبع : آفتاب

کشت سلول

مطالب مشابه :

PCR چيست ؟

وي اس تي چيست؟

فرق دستگاه و آواز چيست؟

کنترل کیفی و کالیبراسیون لوپ میکروب شناسی

کشت سلول

بهترین نرم افزار آهنگسازی چیست؟

مبدل میدی به یو اس بی