تجهیزات71- دستگاه الكتروفورز
آزمايشي در فضاي تعليق معرفي دستگاه الكتروفورز
الكتروفورز از شناخته شده ترين روش هاي آزمايشگاهي براي جداسازي بيومولكول‌ها است. اين روش در سال 1807 توسط Reuss كشف شد. او مشاهده كرد كه ذرات خاك رس تحت تاثير ميدان الكتريكي در آب پراكنده مي شوند. به طور كلي الكتروفورز حركت ذرات پراكنده در داخل مايعي تحت تاثير يك ميدان الكتريكي يكنواخت است. همين حركت در فضايي با ميدان الكتريكي غير يكنواخت دي الكتروفورز ناميده مي شود.
الكتروفورز بدين دليل اتفاق مي افتد كه ذرات معلق در مايع معمولا داراي بار الكتريكي سطحي هستند و ميدان الكتريكي نيروي كولوني الكترواستاتيك به اين ذرات باردار اعمال مي‌كند. اخيرا شبيه سازي هاي ديناميك مولكولي، نظريه اي بيان داشته اند مبني بر اينكه براي انجام الكتروفورز حتما نبايد ذرات بار سطحي داشته باشند و حتي ذرات خنثي نيز به علت ساختار مولكولي خاصي كه آب به عنوان مايع واسط دارد، مي توانند الكتروفورز شوند.
نيروي كولوني الكترواستاتيك اعمال شده به بار سطحي، با نيروهاي مخالف الكترواستاتيك كاهش پيدا مي كند. بر طبق تئوري لايه مضاعف، تمام سطوح بار دار در مايعات با لايه اي از بار مخالف پوشانده مي‌شوند كه از نظر مقداري كاملا برابر با بار سطحي است اما با علامت مخالف آن. ميدان الكتريكي همانند بار سطحي به اين لايه نيرو وارد مي كند. مجموع اين نيروها برابر است با اولين نيروي نامبرده، اما در جهت مخالف آن. در حقيقت اين نيرو به يون هاي موجود در لايه ثانويه اعمال مي شود. اين يون ها در فاصله اي از سطح ذره قرار مي گيرند و بخشي از اين نيروي الكترواستاتيك را از طريق تنش برش سيال به سطح ذره منتقل مي‌‌كنند اين بخش از نيرو كه به بدنه ذره وارد مي شود، نيروي منفي الكتروفورتيك ناميده مي شود.
يك نيروي الكتريكي ديگر نيز وجود دارد كه مرتبط با انحراف لايه ثانويه است و مربوط به تقارن كروي و رسانايي سطح است و به سبب زيادي يون ها در لايه ثانويه به وجود مي‌آيد. اين نيرو نيروي تخفيف الكتروفورتيك ناميده مي شود.
تمام اين نيروها با اصطكاك هيدروديناميك، به تعادل مي‌رسند و باعث حركت ذرات در سيال مي شود. سرعت اين حركت v، متناسب با شدت ميدان الكتريكي E است (البته در صورتي‌كه اين ميدان خيلي قوي نباشد.) ضريب اين تناسب تحرك پذيري الكتروفورتيك است كه رابطه بين شدت ميدان الكتريكي و سرعت ذره را مشخص مي نمايد:
ماكرومولكول هايي مانند اسيد نوكلئيك، DNA و پروتئين ها نيز باردار هستند و مي‌توان با قرار دادن آن‌ها در يك ميدان الكتريكي، بر مبناي خاصيت الكتروفورز آن‌ها را تفكيك كرد. سرعت حركت مولكول‌ها در اين شرايط نه تنها تحت تاثير بار الكتريكي و شدت ميدان الكتريكي است، بلكه عواملي نظير اندازه، وزن مولكولي و شكل فضايي مولكول نيز در اين امر دخيل هستند. همچنين اثرات محيطي نظير نوع و نحوه استفاده از بافرها و حرارت ايجاد شده در حين كار نيز از عوامل موثر بر جداسازي مولكول‌هاي نمونه هستند. معمولا الكتروفورز براي تفكيك مولكول‌هاي بزرگي چون پروتئين ها و اسيدهاي نوكلئيك به كار برده مي شود، اما در مواردي نيز براي جداسازي مولكول‌هاي باردار كوچك‌تر نظير قندها، اسيدهاي آمينه، پپتيدها و حتي يون‌هاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد.
در طي قرن 20 ميلادي چندين تئوري براي محاسبه اين پارامتر به وجود آمده اند. كه مهم‌ترين آن‌ها نظريه Smoluchowski در سال 1903 ميلادي بود.
Arne Tiselius در سال 1948 به خاطر زحماتي كه براي الكتروفورز و آناليز جذبي كشيد برنده جايزه نوبل شد و از اين رو او را پدر الكتروفورز ناميدند. اولين الكتروفورز نيز الكتروفورز بدون مرز تيسليوس نام داشت كه به وسيله آن محلول هاي پروتئيني غليظ را در يك تيوب U شكل بزرگ كه به وسيله بافر پوشانده شده بود، مورد آزمايش قرار مي دادند. اين روش الكتروفورز بسيار مشكل بود، به همين دليل در سال 1950 تغييراتي در عملكرد آن اعمال شد. ابتدا از فيلترهاي كاغذي و استات سلولز استفاده مي شد، اما به دليل ظرفيت محدود و رزولوشن پايين اين مواد، جاي خود را به ژل دادند. ژل هاي استفاده شده در آن زمان به علت بزرگ بودن خلل و فرج ها قادر نبودند پروتئين ها را به تفكيك سايز جداسازي كنند، از اين رو به تدريج به ژل هايي چون آگاروز دست يافتند.
امروزه الكتروفورز ژلي از بخش هاي جدا ناپذير هر تحقيق و فعاليت هاي آزمايشگاهي به منظور جداسازي ماكرومولكول‌هااست. محدوده وسيعي از فعاليت هاي آزمايشگاهي تحقيقاتي و كلينيكي مانند تسلسل ژن ها، جداسازي كروموزوم ها، جداسازي و تعيين خصوصيات پروتئين ها توسط اين روش انجام مي گيرد. علاوه بر اين، استفاده از الكتروفورز از مرز آزمايشگاه‌ها فراتر رفته و به عنوان شاهدي براي وكلا، قضات و هيات منصفه در امور قضايي محسوب مي‌شود. تشخيص هويت DNA به خصوص در موارد تعويض نوزاد در بيمارستان ها و تعيين والدين فرد كاربرد بسياري در علوم ژنتيك پيدا كرده است.
در حال حاضر آگاروز و پلي كريل آميد متداول ترين و پر كاربردترين ماده به عنوان واسط در الكتروفورز ژلي محسوب مي شوند. در اغلب دستگاه‌هاي الكتروفورز، ژل مابين دو محفظه بافري قرار مي گيرد به طوري‌كه ژل تنها واسطه در عبور جريان الكتريسيته بين اين دو محفظه باشد. هر دو شبكه خلل و فرج داري توليد مي كنند كه ميكرومولكول‌هايي بارداري را كه در پاسخ به ميدان الكتريكي جابه جا مي شوند در خود جاي مي دهند. به عنوان مثال زماني كه جريان اعمال مي شود، DNA هاي با بار منفي به سمت الكترودهاي باردار مثبت حركت مي كنند. خلل و فرج هاي موجود در شبكه ژلي انتقال مولكول‌هاي بزرگ را محدود مي كنند و اين در حالي است كه مولكول‌هاي كوچك‌تر با آزادي بيشتري منتقل مي شوند و در فاصله دورتري از الكترودها قرار مي گيرند. اين غربال مولكولي مولكول‌ها را بر مبناي سايزشان جدا مي كند. همچنين مي توان مولكول ها را بر مبناي بار اوليه اي كه داشتند جداسازي كرد. مولكول‌هايي كه بار بيشتري دارند تحرك الكتروفورزي بيشتري از خود نشان مي‌دهند و سريع‌تر منتقل مي شوند بدين ترتيب درون ژل با اولويت باري كه داشتند قرار مي‌گيرند. جداسازي بر مبناي بار به ژلي نياز دارد كه مانند آگاروز داراي خلل و فرج هاي بزرگ‌تري باشند. آگاروز براي جداسازي اسيد نوكلئيك ها و پروتئين هاي خيلي بزرگ يا تركيب ها استفاده مي شود. آگاروز يك پلي ساكاريد طبيعي است كه از نوع خاصي جلبك دريايي قرمز به دست مي آيد. زماني كه گرما داده شده و سپس سرد مي‌شود به صورت جامد متخلخلي با خلل و فرج هاي نسبتا بزرگ تبديل مي‌شود. الكتروفورز ژل آگاروز (AGE) را مي توان براي جداسازي مولكول‌ها بر مبناي بار يا وزن مولكولي‌شان استفاده كرد. يكي از مهم‌ترين كاربردهاي AGE جداسازي بخش هاي حاصل از برش DNA با آنزيم هاي محدودكننده است.
در طي انجام الكتروفورز ثابت نگاه داشتن حرارت اهميت بسياري دارد چرا كه به حفظ تكرار پذيري آزمايش كمك مي كند. به عنوان مثال پليمريزه شدن آكريل آميد يك واكنش گرمازا است و گرماي حاصله به خصوص در مورد ژل هاي غليظ تر، ممكن است باعث بروز بي نظمي در اندازه ي منافذ ژل شود. انتقال گرما معمولا مشكلي در ژل هايي با غلظت كمتر از %15 T ايجاد نمي‌كند. البته ممكن است بالا رفتن دما مشكلات ديگري چون شكستن شيشه هاي الكتروفورز و آسيب به دستگاه را منجر شود. پروتئين‌ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH محيط بارالكتريكي خاص خود را نشان مي دهند. بدين علت در جداسازي توسط الكتروفورز بايد pH محلول هاي مورد استفاده ثابت باقي بماند. از آنجا كه الكتروليز آب در آند يون‌اي "H+" و در كاتود يون‌هاي "OH-" ايجاد مي‌كند، براي ثابت نگاه داشتن pH محلول‌هاي مورد استفاده، بايد آن‌ها را بافر كرد.
نوع ديگري از الكتروفورز، الكتروفورز مويين (CE) است. اين تكنيك كه عمده ترين كاربرد آن در شيمي دارويي و درماني است، براي جداسازي مولكول‌هاي درشت و ريز در مجاري بسيار نازك (با قطر داخلي 200-20ميكرومتر) استفاده مي شود. در اين روش، جداسازي با ولتاژ بالا kV) 30-10) امكان پذير مي‌شود. از محاسن CE مي توان به سرعت دستيابي به نتيجه در آناليز يون ها اشاره كرد. به طور كلي CE بيشتر زماني مطرح مي شود كه با آناليت هاي باردار با پلاريته و قطبيت زياد سر و كار داريم. اين تكنولوژي در علوم بايوتكنولوژي جايگاه ويژه اي پيدا كرده و در آناليز ماكرومولكول‌هايي چون پروتئين ها و كربوهيدرات‌ها جايگزين خوبي براي الكتروفورز سنتي به شمار مي رود. همچنين تكنولوژي CE براي سرعت بخشي به رشد علم ژنتيك به خدمت گرفته شده است. استفاده از الكتروفورز موئين در علوم تحليلي به خصوص در زمينه دارويي و زهر شناسي رشد بسياري داشته است.
الكتروفورز موئين در بر گيرنده چندين تكنيك است كه عملكرد و مشخصه هاي متفاوتي با هم دارند. اين تكنيك ها كه به مودهاي الكتروفورز موئين معروف هستند عبارتند از: الكتروفورز ناحيه اي موئين (CZE)، تمركز ايزوالكتريك (IEF)، الكتروفورز موئين ژلي، ايزوتاكوفورز (ITP) و كروماتوگرافي الكتروسينتيك موئين.
نوع ديگري از الكتروفورز كه قديمي ترين نوع اين تكنيك محسوب مي شود، الكتروفورز سطحي نام دارد. در اين روش از يك لايه كاغذي متخلخلي با طول 10-20 سانتيمتر، ترموپلاستيكي متشكل از سلولز و اسيد استيك و ژل پليمر استفاده مي شود.
تشخيص هويت DNA به وسيله الكتروفورز، اندازه گيري هر رشته و شمارش تعداد بخش ها و برش هاي تكرار شده در آن است. دانشمندان براي اين كار از روش الكتروفورز ژلي استفاده مي كنند. بدين ترتيب كه با جريان الكتريكي رشته هاي DNA را از ميان ژل عبور مي دهند. چون هر بيت از DNA داراي بار منفي است و در معرض نيروي الكتريكي با بار برابر قرار مي گيرد و آن را به سمت وجهي از ژل كه بار مثبت دارد، پيش مي برد. ذرات كوچك‌تر سريع‌تر حركت مي كنند. وقتي جريان برداشته مي شود، از ژل تصويري گرفته مي شود تا مشخص شود هر بيت چه قدر جابه‌جا شده است. با مقايسه باندهاي ايجاد شده با نمونه هاي استاندارد كه سايزهاي شناخته شده اي دارند، طول هر بخش از DNA به دقت اندازه گيري مي شود.
منبع: نشریه مهندسی پزشکی شماره ۹۴
مطالب مشابه :
پروتكل (الكتروفورز DNA روي ژل آگارز) Electrophoresis
ژن درمانی ، درمان دردهای بی درمان - پروتكل (الكتروفورز DNA روي ژل آگارز) Electrophoresis - نقطه ایی که
دانلود کلیپ زیبا در مورد تهیه ژل آگاروز و انجام الکتروفورز
گیاهپزشکی110 - دانلود کلیپ زیبا در مورد تهیه ژل آگاروز و انجام الکتروفورز - دانلود جزوات
دستگاه الکتروفورز
اين دستگاه جهت الکتروفورز کردن قطعات بزرگ dna در داخل ژل آگارز الکتروفورز ژل آگاروز
جداسازی DNA با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگاروز
Sssssepideh Famillllllll Iraniiiiiiiiiii - جداسازی DNA با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگاروز - دفتر یادداشت
الکتروفورز(محاسن و معایب)
محاسن ژل آگاروز. 1. ارزان قیمت است. 2. نگه داری و تهیه ی آن آسان است. 3. شفافیت بالایی دارد. 4.
درباره ی الکتروفورز
محاسن ژل آگاروز. 1. ارزان قیمت است. 2. نگه داری و تهیه ی آن آسان است. 3.
تجهیزات71- دستگاه الكتروفورز
اين مواد، جاي خود را به ژل كنند، از اين رو به تدريج به ژل هايي چون آگاروز دست
برچسب :
ژل آگاروز