وسترن بلات
وسترن بلات (Western blot)
وسترن بلات وسترن بلات یکی از متدهای ایمنواسی میباشد که برای آشکار سازی پروتئین در بافتها و مایعات مختلف کاربرد دارد. این روش یک روش ترکیبی از الکتروفورز و انتقال پروتئین ها به یک فاز جامد میباشد. وسترن بلات اغلب به عنوان یک روش برای بررسی و تائید حضور یک آنتی بادی در بدن برای تائید بیماری هایی مانند ایدز و یا بیماری لایم میباشد. برای انجام این تست نمونه به صورت یک لکه در انتهای لایه ژل قرار داده میشود. معمولا نمونه ها و کنترل با رعایت فاصله مناسب در کنار هم قرار داده میشوند. پروتئین موجود در نمونه تحت جریان الکتریکی که در محیط ایجاد میشود بر اساس سایز از یکدیگر جدا شده و باندهایی را بر روی این لایه ژل ایجاد میکنند. سپس این نوار های ایجاد شده از نمونه و کنترل به یک غشا نیتروسلولز از طریق تماس غشا با ژل انتقال داده میشود و در نهایت برای آشکارسازی پروتئین های موجود در نمونه که به غشا اتصال پیدا کردهاند از آنتی بادی نشانه دار ضد پروتئین مورد نظر استفاده میشود. برای مثال برای تائید بیماری ایدز بعد از جداسازی پروتئین ها و انتقال به غشا آنتی بادی نشاندار علیه آنتی بادی ساخته شده در بدن انسان به غشا اضافه کرده و در انتها از مقایسه باندهای آشکار شده با الگوهای حاصل از کنترل مثبت و منفی به تائید بیماری و یا رد آن میپردازند. این روش آزمایشگاهی دارای ۳ مرحله است: اول انتقال به ژل الکتروفورز دوم انتقال به غشاء نیتروسلولز سوم شناسایی پروتئین اختصاصی ابتدا پروتئینهای تفکیک شده بر روی ژل الکتروفورز به غشاء منتقل میشود. سپس از پادتن‌ها (آنتی بادی‌ها) برای مشخص کردن پروتئینها استفاده میشود. انتقال در این مرحله پروتئین را از ژل به غشای نیتروسلولزی یا پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) منتقل میکنیم. بدین منظور غشا روی ژل قرار گرفته و از کاغذهای فیلتر هم استفاده میشود. به دو روش این کار را انجام میدهیم: 1. غیرفعال: ساندویچی از ژل، غشا و کاغذهای فیلتری را در محلول بافر قرار میدهیم. در این روش حرکت موئین باعث میشود پروتئینها به سمت کاغذ نیتروسلولزی حرکت کرده و بنابراین به غشا منتقل شوند. این روش بسیار زمانبر است و برای انتقال کامل پروتئین 1 تا 2 روز زمان لازم است. 2. فعال: این روش سریعتر و کارآمدتر است و در آن از جریان الکتریکی استفاده میشود و پروتئینهای با بار منفی به سمت قطب مثبت حرکت کرده به غشا وارد میشوند. به این روش الکتروبلاتینگ میگویند. چند نکته در مورد غشا: برای بررسی پروتئینهای با وزن ملکولی کمتر از KD10 از غشای نیتروسلولزی استفاده میشود زیرا ظرفیت اتصال خیلی بیشتر است. در ضمن ...
وسترن بلات
وسترن بلات یکی از متدهای ایمنواسی میباشد که برای آشکار سازی پروتئین در بافتها و مایعات مختلف کاربرد دارد. این روش یک روش ترکیبی از الکتروفورز و انتقال پروتئین ها به یک فاز جامد میباشد. وسترن بلات اغلب به عنوان یک روش برای بررسی و تائید حضور یک آنتی بادی در بدن برای تائید بیماری هایی مانند ایدز و یا بیماری لایم میباشد. برای انجام این تست نمونه به صورت یک لکه در انتهای لایه ژل قرار داده میشود. معمولا نمونه ها و کنترل با رعایت فاصله مناسب در کنار هم قرار داده میشوند.پروتئین موجود در نمونه تحت جریان الکتریکی که در محیط ایجاد میشود بر اساس سایز از یکدیگر جدا شده و باندهایی را بر روی این لایه ژل ایجاد میکنند. سپس این نوار های ایجاد شده از نمونه و کنترل به یک غشا نیتروسلولز از طریق تماس غشا با ژل انتقال داده میشود و در نهایت برای آشکارسازی پروتئین های موجود در نمونه که به غشا اتصال پیدا کرده اند از آنتی بادی نشانه دار ضد پروتئین مورد نظر استفاده میشود. برای مثال برای تائید بیماری ایدز بعد از جداسازی پروتئین ها و انتقال به غشا آنتی بادی نشاندار علیه آنتی بادی ساخته شده در بدن انسان به غشا اضافه کرده و در انتها از مقایسه باندهای آشکار شده با الگوهای حاصل از کنترل مثبت و منفی به تائید بیماری و یا رد آن میپردازند.
بررسی روش وسترن بلات يا ايمنو بلات:
در تكنيك ELISA پروئين ها در سطح حفرات پليت پوشش داده مي شوند و در انتهاي آزمايش ELISA ،از يك واكنش رنگ زا براي شناسايي انجام واكنش يا عدم انجام آن استفاده مي شود.اما در وسترن بلات ابتدا پروتئين توسط الكترو فورز روي ژل اكريل اميد جدا شده ، سپس توسط جريان الكتريكي به غشاء نيترو سلولوز انتقال داده مي شوند. اين غشا شبيه به كاغذ معمولي است ، ام اندازه حفرات آن كاملا مشخص است و توانايي زيادي در اتصال به پروتئين دارد پس از اينكه پروتئين به غشاء نيترو سلولوز انتقال داده شد بقيه مراحل شبيه به ELISA طي مي شود ف با اين تفاوت كه مسير حركت هر نمونه به شكل يك نوار بريده مي شود و درون ظزف خاصي كه شيار هايي به اندازه نوار بريده شده ، قرار مي گيرد و بقيه مراحل در اين ظرف انجام مي گيرد . به اين ترتيب به طور مثال اگر نمونه كشت ويروس HIV در اختيار داشته باشيم ، بايد ابتدا انرا الكترو فورز نماييم . پس از الكترو فورز باندهاي پروتئيني را به gp۴۱ و gp۱۲۰ هر يك بنا به اندازه مولكول آن ها ، روي ژل تفكيك مي شوند .اكنون باندهاي پروتئين را به غشاي نيترو سلولز انتقال داده تا مراحل بعدي به راحتي صورت گيرد.پس از اينكه پروتئين ها به غشاي نيترو سلولوز منتقل شدند ، مرحله بعدي ميتواند به دو گونه طراحي شود : الف) بعضي از مواقع هدف شناسايي پروتئين خاص در پروتئين هاي الكتروفورز شده است . اين حالت بيشتر در تحقيقات كاربرد دارد. ب) در برخي موارد نيز مخلوط پروتيني ماهيت مشخصي دارد و حتي وزن مولكولي پروتئين هاي اين مخلوط و موقعيت آن ها پس از الكترو فورز مشخص مي باشند. در اين موارد مي توان حضور آنتي بادي عليه پروتئين هاي را در سرم مورد آزمايش بررسي نمود. در اكثر موارد تشخيص از يان روش استفاده مي شود . به طور مثال پروتئين هاي ويروس HIV الكترو فورز شده ،سپس به غشاي نيترو سلولوز منتقل مي شود . اكنون پس از مجاورت با سرم انساني هدف ازمايش بررسي وجود انتي بادي عليه پروتئين غشايي يا مركزي HIV است. در اين مواقع علاوه بر حضور يا عدم حضور آنتي بادي اختصاصي مي توانيم مشخص سازيم كه آنتي فرد عليه چه جزئي از عامل بيماري زا است. به اين ترتيب موارد مثبت كاذب مشاهده شده در آزمون ELISA در اينجا حذف مي شود و به طور اختصاصي واكنش دهي آنتي بادي ،مورد آزمون قرار مي گيرد . در بسياري مواقع كه چندين بار (۲ تا ۳ بار) تست ELISA يك عامل عفوني خطرناك براي يك بيمار مثبت مي گردد ، جهت تاييد تست الايزا از تست وسترن بلات استفاده مي شود نظير عفونت هاي HIV ، HTLV و HSV . البته امروزه براي بسياري از عفونت هاي ويروسي و باكتريايي تست تاييد وسترن بلات موجود است . به لحاظ تكنيكي در مواردي كه هدف ارزيابي حضور ...
وسترن بلات
وسـتـرن بـلاتينـگ وسترن بلاتینگ شامل جد‌اسازي مخلوط پروتئيني بر روي ژل و سپس انتقال آن‌ها به يك غشاي مناسب است. سپس مـلـكــول پــروتـئـيـن از طـريـق ميـانكنـش بـا يـك آنـتــي‌بــادي اخـتـصــاصــي نـشــانــدار، شـنــاســايـي مي‌شود. از آنجائي‌كه غالباً وسترن بلاتينگ را به كمك اتصال آنتي بادي ها مورد تجزيه و تحليل قرار مي دهند، به آن ايمونو بلاتينگ نيز گفته مي شود. کلمه ی بلاتینگ به روش انتقال اشاره دارد و کلمه ی ایمونو به خاطر لزوم استفاده از واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی اختصاصی در مرحله ی شناسایی می باشد. این تکنیک توسط Towbin و همكاران در سال 1979، ابداع گردیده است و تركيبي از الكتروفورز و انتقال پروتئين ها به يك فاز جامد است. با اين روش مي‌توان اطلاعاتي در مورد خصوصيات مختلف آنتي‌ژن‌هاي پروتئيني شامل وجود و مقدار آنتي‌ژن، وزن ملكولي پروتئين، ايزوفرم‌ها و محصولات شكسته شده آن و كارايي روش استخراج آنتي‌ژن به دست آورد. در عین حال وسترن بلات اطلاعاتی در مورد اینکه چه مقدار پروتئين در سلول وجود دارد در اختیار ما قرار می دهد.
وسترن بلاتینگ(ایمونو بلات)
وسترن بلاتینگ یکی از روشهای بلاتینگ است که برای تشخیص و آنالیز پروتئینها استفاده میشود.این روش آزمایشگاهی دارای ۳ مرحله است: اول انتقال به ژل الکتروفورز دوم انتقال به غشاء نیتروسلولز و سوم شناسایی پروتیین اختصاصی. ابتدا پروتئینهای تفکیک شده بر روی ژل الکتروفورز به غشاء منتقل میشود. سپس ازآنتی بادی‌ها برای مشخص کردن پروتئینها استفاده میشود.انیمیشن مربوط به وسترن بلات رو از اینجــا دانلود کنید.اما قبل از دانلود:
روش وسترن بلات يا ايمنو بلات
همان طوركه مي دانيم در تكنيك ELISA پروئين ها در سطح حفرات پليت پوشش داده مي شوند و در انتهاي آزمايش ELISA ،از يك واكنش رنگ زا براي شناسايي انجام واكنش يا عدم انجام آن استفاده مي شود.اما در وسترن بلات ابتدا پروتئين توسط الكترو فورز روي ژل اكريل اميد جدا شده ، سپس توسط جريان الكتريكي به غشاء نيترو سلولوز انتقال داده مي شوند. اين غشا شبيه به كاغذ معمولي است ، ام اندازه حفرات آن كاملا مشخص است و توانايي زيادي در اتصال به پروتئين دارد پس از اينكه پروتئين به غشاء نيترو سلولوز انتقال داده شد بقيه مراحل شبيه به ELISA طي مي شود ف با اين تفاوت كه مسير حركت هر نمونه به شكل يك نوار بريده مي شود و درون ظزف خاصي كه شيار هايي به اندازه نوار بريده شده ، قرار مي گيرد و بقيه مراحل در اين ظرف انجام مي گيرد . به اين ترتيب به طور مثال اگر نمونه كشت ويروس HIV در اختيار داشته باشيم ، بايد ابتدا انرا الكترو فورز نماييم . پس از الكترو فورز باندهاي پروتئيني را به gp۴۱ و gp۱۲۰ هر يك بنا به اندازه مولكول آن ها ، روي ژل تفكيك مي شوند .اكنون باندهاي پروتئين را به غشاي نيترو سلولز انتقال داده تا مراحل بعدي به راحتي صورت گيرد . پس از اينكه پروتئين ها به غشاي نيترو سلولوز منتقل شدند ، مرحله بعدي ميتواند به دو گونه طراحي شود : الف) بعضي از مواقع هدف شناسايي پروتئين خاص در پروتئين هاي الكتروفورز شده است . اين حالت بيشتر در تحقيقات كاربرد دارد . ب) در برخي موارد نيز مخلوط پروتيني ماهيت مشخصي دارد و حتي وزن مولكولي پروتئين هاي اين مخلوط و موقعيت آن ها پس از الكترو فورز مشخص مي باشند. در اين موارد مي توان حضور آنتي بادي عليه پروتئين هاي را در سرم مورد آزمايش بررسي نمود. در اكثر موارد تشخيص از يان روش استفاده مي شود . به طور مثال پروتئين هاي ويروس HIV الكترو فورز شده ،سپس به غشاي نيترو سلولوز منتقل مي شود . اكنون پس از مجاورت با سرم انساني هدف ازمايش بررسي وجود انتي بادي عليه پروتئين غشايي يا مركزي HIV است. در اين مواقع علاوه بر حضور يا عدم حضور آنتي بادي اختصاصي مي توانيم مشخص سازيم كه آنتي فرد عليه چه جزئي از عامل بيماري زا است . به اين ترتيب موارد مثبت كاذب مشاهده شده در آزمون ELISA در اينجا حذف مي شود و به طور اختصاصي واكنش دهي آنتي بادي ،مورد آزمون قرار مي گيرد . در بسياري مواقع كه چندين بار (۲ تا ۳ بار) تست ELISA يك عامل عفوني خطرناك براي يك بيمار مثبت مي گردد ، جهت تاييد تست الايزا از تست وسترن بلات استفاده مي شود نظير عفونت هاي HIV ، HTLV و HSV . البته امروزه براي بسياري از عفونت هاي ويروسي و باكتريايي تست تاييد وسترن بلات موجود است . به لحاظ تكنيكي در ...
وسترن بلات
Western Blot Activity Background Whereas ELISA measures antibody to whole virus and gives a "positive," "negative" or indeterminate test result, Western blotting is a more specific test. It allows one to visualize antibodies directed against each viral protein. For this reason, it is a confirmatory test for a positive HIV ELISA. In an HIV Western blotting, proteins are electrophoresed into a gel. As the proteins migrate through the gel they are separated based upon size and charge. Characteristically, smaller proteins migrate through the gel faster than larger protein
تکنیک وسترن بلات
تکنیک وسترن بلات
وسترن بلاتینگ
دستگاه الکتروبلاتینگ : این دستگاه محفظه ای شیشه ای به شکل زیر است که جایگاه ویژه ای برای فروبردن یک کاست مخصوص در آن قرار دارد (در سطح داخلی دیواره شیشه ای در دو طرف مقابل هم، دو زایده از جنس شیشه، ناودان خاصی را ایجاد می کنند که کاست در درون آن قرار گرفته و ثابت می شود) در دو طرف این جایگاه دو الکترود تعبیه شده اند جنس آند از پلاتین و فیش آن به رنگ قرمز است جنس کاتد از استیل و فیش آن سیاه رنگ می باشد جنس کاست از شیشه بوده و دارای سوراخ های درشت در قسمت های جانبی است تا جریان الکتریکی براحتی از آن عبور کند. کاست به کمک اسفنج ها، محفظه تنگ و فشرده ای را بوجود می آورد که از دو طرف فشار آورده و سطح رو در روی ژل با غشا را به هم نزدیکتر می کند. کاست منطقه لولا مانندی دارد که بواسطه آن به طرفین باز می شود. در سطح داخلی آن ابتدا دو لایه ضخیم اسفنج در طرفین قرار داده می شود بین این دو اسفنج از طرف کاتد (دقت شود) به ترتیب کاغذ صافی (سه برگ) و ژل و غشای نیتروسلولزی و کاغذ صافی (سه برگ) قرار داده می شود. غشا و کاغذ صافی ها قبلا با بافر بلوتینگ کاملا خیس می شوند (حدود 15 دقیقه). وقتی غشای نیتروسلولز و ژل و اسفنج و کاغذ صافی ها به طور صحیح !! در محل خود قرار داده شدند و کاست در جهتی صحیح !! در ناودان خاص خود در داخل دستگاه فرو برده شد نوبت به اتصال سیم های رابط می رسد. دو الکترود دستگاه به دو جا فیش قرمز و سیاه متصل هستند که در بالای دستگاه در معرض دید قرار دارد. دو فیش موجود در دو انتهای سیم رابط قرمز رنگ به جا فیش های قرمز رنگ موجود در دستگاه بلاتینگ و منبع تغذیه وصل می شوند. دو فیش مشکی در دو انتهای سیم رابط مشکی نیز به دو جافیش مشکی رنگ موجود در دستگاه بلاتینگ و منبع تغذیه وصل می شود. وقتی از صحیح بودن جهت قرار گیری ژل به غشا (ژل به طرف کاتد و غشا به طرف آند) و صحیح بودن اتصال سیم های رابط مطمئن شدید وقت آن رسیده است که منبع تغذیه روشن شود. روش کار با منبع تغذیه: منبع تغذیه طوری ساخته می شود که می تواند یکی از فاکتورها (ولت یا آمپر) را ثابت نگه دارد. قبل از وصل کردن منبع تغذیه به برق شهری و قبل از روشن کردن کلید آن (اگر کلیدهای تنظیم کننده ولت و آمپر از آزمایش قبلی در آخرین درجه باز مانده باشند امکان سوختن فیوز دستگاه به دلیل عبور جریان زیاد وجود دارد) هر دو کلید ولتاژ و شدت جریان را کاملا می بندیم سپس دستگاه را به برق 220 ولت شهری وصل کرده و کلید دستگاه را از حالت off به حالت on در می آوریم. سپس اگر می خواهیم شدت جریان (آمپر) توسط دستگاه ثابت نگه داشته شود ابتدا کلید مربوط به ولتاژ را تا آخرین حد باز می کنیم و در مرحله بعد کلید مربوط به شدت جریان ...
روش وسترن بلات يا ايمنو بلات
همان طوركه مي دانيم در تكنيك ELISA پروئين ها در سطح حفرات پليت پوشش داده مي شوند و در انتهاي آزمايش ELISA ،از يك واكنش رنگ زا براي شناسايي انجام واكنش يا عدم انجام آن استفاده مي شود.اما در وسترن بلات ابتدا پروتئين توسط الكترو فورز روي ژل اكريل اميد جدا شده ، سپس توسط جريان الكتريكي به غشاء نيترو سلولوز انتقال داده مي شوند. اين غشا شبيه به كاغذ معمولي است ، ام اندازه حفرات آن كاملا مشخص است و توانايي زيادي در اتصال به پروتئين دارد پس از اينكه پروتئين به غشاء نيترو سلولوز انتقال داده شد بقيه مراحل شبيه به ELISA طي مي شود ف با اين تفاوت كه مسير حركت هر نمونه به شكل يك نوار بريده مي شود و درون ظزف خاصي كه شيار هايي به اندازه نوار بريده شده ، قرار مي گيرد و بقيه مراحل در اين ظرف انجام مي گيرد . به اين ترتيب به طور مثال اگر نمونه كشت ويروس HIV در اختيار داشته باشيم ، بايد ابتدا انرا الكترو فورز نماييم . پس از الكترو فورز باندهاي پروتئيني را به gp۴۱ و gp۱۲۰ هر يك بنا به اندازه مولكول آن ها ، روي ژل تفكيك مي شوند .اكنون باندهاي پروتئين را به غشاي نيترو سلولز انتقال داده تا مراحل بعدي به راحتي صورت گيرد . پس از اينكه پروتئين ها به غشاي نيترو سلولوز منتقل شدند ، مرحله بعدي ميتواند به دو گونه طراحي شود : الف) بعضي از مواقع هدف شناسايي پروتئين خاص در پروتئين هاي الكتروفورز شده است . اين حالت بيشتر در تحقيقات كاربرد دارد . ب) در برخي موارد نيز مخلوط پروتيني ماهيت مشخصي دارد و حتي وزن مولكولي پروتئين هاي اين مخلوط و موقعيت آن ها پس از الكترو فورز مشخص مي باشند. در اين موارد مي توان حضور آنتي بادي عليه پروتئين هاي را در سرم مورد آزمايش بررسي نمود. در اكثر موارد تشخيص از يان روش استفاده مي شود . به طور مثال پروتئين هاي ويروس HIV الكترو فورز شده ،سپس به غشاي نيترو سلولوز منتقل مي شود . اكنون پس از مجاورت با سرم انساني هدف ازمايش بررسي وجود انتي بادي عليه پروتئين غشايي يا مركزي HIV است. در اين مواقع علاوه بر حضور يا عدم حضور آنتي بادي اختصاصي مي توانيم مشخص سازيم كه آنتي فرد عليه چه جزئي از عامل بيماري زا است . به اين ترتيب موارد مثبت كاذب مشاهده شده در آزمون ELISA در اينجا حذف مي شود و به طور اختصاصي واكنش دهي آنتي بادي ،مورد آزمون قرار مي گيرد . در بسياري مواقع كه چندين بار (۲ تا ۳ بار) تست ELISA يك عامل عفوني خطرناك براي يك بيمار مثبت مي گردد ، جهت تاييد تست الايزا از تست وسترن بلات استفاده مي شود نظير عفونت هاي HIV ، HTLV و HSV . البته امروزه براي بسياري از عفونت هاي ويروسي و باكتريايي تست تاييد وسترن بلات موجود است . به لحاظ تكنيكي ...