وسترن بلات (Western blot)

وسترن بلات

وسترن بلات یکی از متدهای ایمنواسی میباشد که برای آشکار سازی پروتئین در بافتها و مایعات مختلف کاربرد دارد. این روش یک روش ترکیبی از الکتروفورز و انتقال پروتئین ها به یک فاز جامد میباشد. وسترن بلات اغلب به عنوان یک روش برای بررسی و تائید حضور یک آنتی بادی در بدن برای تائید بیماری هایی مانند ایدز و یا بیماری لایم میباشد. برای انجام این تست نمونه به صورت یک لکه در انتهای لایه ژل قرار داده میشود. معمولا نمونه ها و کنترل با رعایت فاصله مناسب در کنار هم قرار داده میشوند. پروتئین موجود در نمونه تحت جریان الکتریکی که در محیط ایجاد میشود بر اساس سایز از یکدیگر جدا شده و باندهایی را بر روی این لایه ژل ایجاد میکنند. سپس این نوار های ایجاد شده از نمونه و کنترل به یک غشا نیتروسلولز از طریق تماس غشا با ژل انتقال داده میشود و در نهایت برای آشکارسازی پروتئین های موجود در نمونه که به غشا اتصال پیدا کردهاند از آنتی بادی نشانه دار ضد پروتئین مورد نظر استفاده میشود. برای مثال برای تائید بیماری ایدز بعد از جداسازی پروتئین ها و انتقال به غشا آنتی بادی نشاندار علیه آنتی بادی ساخته شده در بدن انسان به غشا اضافه کرده و در انتها از مقایسه باندهای آشکار شده با الگوهای حاصل از کنترل مثبت و منفی به تائید بیماری و یا رد آن میپردازند.

این روش آزمایشگاهی دارای ۳ مرحله است:

اول انتقال به ژل الکتروفورز

دوم انتقال به غشاء نیتروسلولز

سوم شناسایی پروتئین اختصاصی

ابتدا پروتئین‌های تفکیک شده بر روی ژل الکتروفورز به غشاء منتقل می‌شود. سپس از پادتن‌ها (آنتی بادی‌ها) برای مشخص کردن پروتئین‌ها استفاده می‌شود.

انتقال

در این مرحله پروتئین را از ژل به غشای نیتروسلولزی یا پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) منتقل میکنیم. بدین منظور غشا روی ژل قرار گرفته و از کاغذهای فیلتر هم استفاده میشود. به دو روش این کار را انجام میدهیم:

1. غیرفعال: ساندویچی از ژل، غشا و کاغذهای فیلتری را در محلول بافر قرار میدهیم. در این روش حرکت موئین باعث میشود پروتئینها به سمت کاغذ نیتروسلولزی حرکت کرده و بنابراین به غشا منتقل شوند. این روش بسیار زمانبر است و برای انتقال کامل پروتئین 1 تا 2 روز زمان لازم است.

2. فعال: این روش سریعتر و کارآمدتر است و در آن از جریان الکتریکی استفاده میشود و پروتئینهای با بار منفی به سمت قطب مثبت حرکت کرده به غشا وارد میشوند. به این روش الکتروبلاتینگ میگویند.

چند نکته در مورد غشا:

برای بررسی پروتئینهای با وزن ملکولی کمتر از KD10 از غشای نیتروسلولزی استفاده میشود زیرا ظرفیت اتصال خیلی بیشتر است. در ضمن غشاهای نیتروسلولزی ارزانترند، اما شکنندهتر بوده و برای تکرارهای بعدی دوام نمیآورند. اما PVDF ضخیمتر و در طی استفاده نسبت به آسیب مقاومتر است. در ضمن قبل از استفاده از PVDF باید آنرا در اتانول 95%، ایزوپروپانول و یا متانول بخیسانیم.

بررسی انتقال پروتئین به غشا

بایستی غشا را با کوماسی برلیانت بلو یا ponceau S رنگ کنیم. رنگ ponceau S معمولتر است زیرا حساستر است و بهتر در آب حل میشود بنابراین رنگ زدایی آن آسانتر است. پس از آنکه از انتقال پروتئینها مطمئن شدیم غشا را با dd H2O شستشو میدهیم.

بلوکه کردن

از آنجاییکه غشا توانایی اتصال به پروتئنها را دارد و هم هدف ما و هم آنتیبادیها پروتئینی هستند بایستی از برهمکنش بین غشا و آنتیبادی جلوگیری شود. بنابراین باید تمامی جاهای خالی غشا را بپوشانیم. بدین منظور از TBS حاوی آلبومین سرم گاوی (BSA) 5% یا شیر خشک بدون چربی با درصد ناچیزی شوینده مثل توئین 20 یا تریتون X100 استفاده میکنیم. بایستی در دمای اتاق و به مدت 30 تا 60 دقیقه در این بافر بماند.

با این عمل آنتیبادیها تنها به مکانهای اتصالی پروتئینهای هدف میچسبد.

شناسایی

در این فرآیند از آنتیبادیهای اولیه و ثانویه برای شناسایی پروتئین هدف استفاده میشود که شامل دو مرحله میباشد.

ابتدا باید بافری حاوی رقت مناسبی از آنتیبادی اولیه را جایگزین محلول بلاکینگ کنیم ( از محلول بلاکینگ میشود چندین بار استفاده کرد. ). به طور معمول این محلول حاوی buffered saline با درصد کمی شوینده و گاهی شیرخشک یا BSA است. در طول این مدت باید محلول را به آرامی تکان دهیم. در ضمن قبل از این مرحله باید صفحهی نیتروسلولزی به صورت نوارهایی بریده شود.

مجموعهی آنتیبادی- آنتیژن در این مرحله قابل رویت نیست.

سپس غشا را شستشو میدهیم تا آنتیبادیهای اولیه که به پروتئین هدف متصل نشدهاند برداشته شوند و سپس آنرا در معرض آنتیبادی ثانویه به مدت 30 دقیقه قرار میدهیم. آنتیبادی ثانویه از منابع حیوانی بهدست میآید .(anti mouse, anti gout,…) پس از این مرحله نیز سه بار و هر بار به مدت 10 دقیقه غشا را در TBS شستشو میدهیم تا آنتیبادیهای ثانویه که به آنتیبادیهای اولیه متصل نشدهاند برداشته شوند.

انواع روشهای تشخیصی

1. تشخیص رنگ سنجی: در این روش آنتیبادی ثانویه متصل به آنزیم در معرض یک سوبسترا قرار میگیرد. این سوبسترا با آنزیم (مثل پراکسیداز) واکنش میدهد و رنگ قابل حل به غیرقابل حل تبدیل شده و در کنار آنزیم رسوب میکند، بنابراین غشا رنگ میشود. سطوح پروتئینی توسط چگالی سنجی و یا از طریق اسپکتروفتومتری ارزیابی میشوند.

2. تشخیص کمیلومینسنت: در این روش هنگامیکه سوبسترا در معرض آنزیم قرار میگیرد لومینسنس تولید میکند. سپس نور تولیدشده توسط فیلم عکاسی و اخیرا بیشتر توسط دوربینهای CCD که تصاویر دیجیتالی میگیرند مشخص میشود. این تصاویر با چگالی سنجی تجزیه و تحلیل میشوند.

3. تشخیص رادیواکتیوی: برچسبهای رادیواکتیوی نیازی به سوبستراهای آنزیمی ندارند. در این روش از قراردادن مستقیم فیلم اشعه X پزشکی در مقابل وسترن بلات استفاده میکنیم و نواحی تیره که معادل باندهای پروتئینی هستند بر روی فیلم ظاهر میشوند. از آنجاییکه این روش گران است و برای سلامتی مضر است و ایمن هم نیست، استفاده از آن کاهش یافته است.

4. تشخیص فلورسنتی: پروبهایی که با فلورسنت برچسبدار میشوند توشط نور تحریک شده و توسط دوربینهای CCD مجهز به فیلترهای تشعشعی که تصاویر دیجیتالی میگیرند، تشخیص داده میشوند و به ما این امکان را میدهند تا دادهای بیشتری را از قبیل وزن ملکولی مورد بررسی قرار دهیم. این روش یکی از حساسترین روشهاست.

تجزیه و تحلیل

در این مرحله باندهای ظاهر شده را با مارکر مقایسه کرده و اندازه آنها را تعیین میکنیم.

< ارائه : سرکار خانم آزاده خواجویی >

وسترن بلات (Western blot)

مطالب مشابه :

وسترن بلات (Western blot)

وسترن بلات

بررسی روش وسترن بلات يا ايمنو بلات:

وسترن بلات

وسترن بلاتینگ(ایمونو بلات)

روش وسترن بلات يا ايمنو بلات

وسترن بلات

تکنیک وسترن بلات

وسترن بلاتینگ

روش وسترن بلات يا ايمنو بلات