کروماتوگرافی

ریشه لغوی

کروماتوگرافی (chromatoghraphy) ، در زبان یونانی chroma یعنی رنگ و grophein یعنی نوشتن است.

اطلاعات اولیه

پر کاربردترین شیوه جداسازی مواد تجزیه‌ای کروماتوگرافی است که در تمام شاخه‌های علوم کاربردهایی دارد. کرماتوگرافی گروه گوناگون و مهمی از روش‌های جداسازی مواد را شامل می‌شود و امکان می‌دهد تا اجزای سازنده نزدیک به هم مخلوط‌های کمپلکس را جدا ، منزوی و شناسایی کند بسیاری از این جداسازی‌ها به روش‌های دیگر ناممکن است.

سیر تحولی رشد

· اولین روش‌های کروماتوگرافی در سال 1903 بوسیله میخائیل سوئت ابداع و نامگذاری شد. او از این روش برای جداسازی مواد رنگی استفاده کرد.

· مارتین و سینج در سال 1952 به پاس اکتشافاتشان در زمینه کروماتوگرافی جایزه نوبل دریافت کردند.

توصیف کروماتوگرافی

کروماتوگرافی را به دلیل اینکه در برگیرنده سیستمها و تکنیکهای مختلفی است نمی‌توان به طور مشخص تعریف کرد. اغلب جداسازی‌ها بر مبنای کروماتوگرافی بر روی مخلوطهایی از مواد بی‌رنگ از جمله گازها صورت می‌گیرد. کروماتوگرافی متکی بر حرکت نسبی دو فاز است ولی در کروماتوگرافی یکی از فازها بدون حرکت است و فاز ساکن نامیده می‌شود و دیگری را فاز متحرک می‌نامند. اجزای یک مخلوط به وسیله جریانی از یک فاز متحرک از داخل فاز ساکن عبور داده می‌شود. جداسازی‌ها بر اساس اختلاف در سرعت مهاجرت اجزای مختلف نمونه استوارند.

روش‌های کروماتوگرافی

روش‌های کروماتوگرافی را می‌توان ابتدا بر حسب ماهیت فاز متحرک و سپس بر حسب ماهیت فاز ساکن طبقه‌بندی کرد. فاز متحرک ممکن است گاز یا مایع و فاز ساکن ممکن است جامد یا مایع باشد. بدین ترتیب فرآیند کروماتوگرافی به چهار بخش اصلی تقسیم می شود. اگر فاز ساکن جامد باشد کروماتوگرافی را کروماتوگرافی جذب سطحی و اگر فاز ساکن ، مایع باشد کروماتوگرافی را تقسیمی می‌نامند.

انواع کروماتوگرافی

هر یک از چهار نوع اصلی کروماتوگرافی انواع مختلف دارد:

· کروماتوگرافی مایع – جامد

o کروماتوگرافی جذب سطحی

o کروماتوگرافی لایه نازک

o کروماتوگرافی تبادل یونی

o کروماتوگرافی ژلی

· کروماتوگرافی گاز – جامد

· کروماتوگرافی مایع – مایع

o کروماتوگرافی تقسیمی

o کروماتوگرافی کاغذی

· کروماتوگرافی گاز- مایع

o کروماتوگرافی گاز – مایع

o کروماتوگرافی ستون مویین

مزیت روشهای کروماتوگرافی

· با روشهای کروماتوگرافی می‌توان جداسازی‌هایی را که به روش‌های دیگر خیلی مشکل می‌باشند انجام داد. زیرا اختلافات جزئی موجود در رفتار جزئی اجسام در جریان عبور آنها از یک سیستم کروماتوگرافی چندین برابر می‌شود‌. هر قدر این اختلاف بیشتر شود قدرت جداسازی مواد بیشتر و برای انجام جداسازی مواد نیاز کمتری به وجود اختلافات دیگر خواهد بود.

· مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که نسبتا آسان می‌توان به آن دست یافت با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد ولی یک جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌تواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام گیرد.

· یکی از مزایای برجسته روش‌های کروماتوگرافی این است که آنها آرام هستند. به این معنی که احتمال تجزیه مواد جداشونده به وسیله این روش‌ها در مقایسه با سایر روش‌ها کمتر است.

· مزیت دیگر روش‌های کروماتوگرافی در این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است به این دلیل روش‌های تجزیه‌ای مربوط به جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌توانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند.

· روش‌های کروماتوگرافی ساده سریع و وسایل مورد لزوم آنها ارزان هستند. مخلوط‌های پیچیده را می‌توان نسبتا به آسانی به وسیله این روش‌ها به دست آورد.

مواد	نوع کروماتوگرافی
مواد شیمیایی مشابه	کروماتوگرافی تقسیمی
مواد شیمیایی غیر مشابه	کروماتوگرافی جذب سطحی
گازها و اجسام فرار	کروماتوگرافی گازی
مواد یونی و معدنی	کروماتوگرافی تبادل یونی در ستون کروماتوگرافی کاغذی یا لایه نازک الکترفورز ناحیه‌ای
مواد یونی و غیر یونی	کروماتوگرافی تبادل یون یا ژلی
مواد زیستی و ترکیباتی با جرم مولکولی نسبی بالا	کروماتوگرافی ژلیالکتروفورز

انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی

انتخاب نوع روش کروماتوگرافی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی مواد گازها) عموما تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی جهت پیش بینی بهترین روش برای جداسازی مواد اجسام مگر در چند مورد ساده وجود ندارد. در ابتدا روش‌های ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می‌شوند. زیرا این روش‌ها در صورتی که مستقیما قادر به جداسازی مواد نباشند نوع سیستم کروماتوگرافی را که جداسازی مواد بوسیله آن باید صورت بگیرد، مشخص می‌کنند آنگاه در صورت لزوم از روش‌های پیچیده‌تر استفاده می‌شود. از فهرست زیر می‌توان به عنوان یک راهنمای تقریبی استفاده کرد‌.

در جداسازی‌های مشکل وقتی که روش‌های ساده فاقد کارایی لازم هستند روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HELC) می تواند جوابگو باشد.

کروماتوگرافی کاغذی (paper chromatoghraphy)

اطلاعات اولیه

انواع جداسازی‌های مختلف و ساده بر روی کاغذ به عنوان پیشروان کروماتوگرافی کاغذی توصیف شده‌اند. این سیستم معمولا به عنوان نمونه بارزی از سیستم تقسیمی در نظر گرفته می‌شود که در آن فاز ساکن آب است و به وسیله جذب سطحی بر روی مولکول‌های سلولز قرار می‌گیرد و مولکول‌های سلولز نیز به نوبه خود به وسیله ساختار الیافی کاغذ در وضعیت‌های ثابت نگه داشته می‌شود. امروزه ، به هر حال ، مشخص شده است که جذب سطحی اجزای فاز متحرک و حل شونده‌ها و اثرات تبادل یون نیز نقش‌هایی را ایفا می‌کنند و کاغذ به هیچ عنوان تنها به صورت تکیه گاه بی اثر نیست.

سیر تحولی رشد

روش پیشنهادی رانگ در سال 1850 و فرآیندی که آن را تجزیه موئینه‌ای می‌نامند، از جمله آنها می‌باشند. چنین روش‌هایی در واقع بیشتر شبیه کروماتوگرافی جذب سطحی بودند و کروماتوگرافی کاغذی به مفهوم فعلی ، گسترش سیستم تقسیمی است که به وسیله مارتین و سینج در سال 1941 ارائه شد. در سال 1944 کونسدن ، گوردن و مارتین اسیدهای آمینه و پپتیدهای موجود در محصول آبکافت ، پروتئین پشم را به وسیله روشی جدا کردند که در آن به جای ستون پودر از یک صفحه یا نوار کاغذی آویزان در داخل یک ظرف سرپوش‌دار استفاده شده بود.

کاربرد

در ابتدا کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مخلوط‌های مواد آلی به کار رفت. ولی بعد از آن ، عمدتا به وسیله برستال و پولارد و همکاران آنها ، برای جداسازی یون‌های معدنی به سرعت به کار گرفته شد. هم آنیون‌ها و هم کاتیون‌ها را به وسیله این روش می‌توان جدا کرد.

خصوصیت ویژه

یک خصوصیت ویژه روش کروماتوگرافی کاغذی این است که چیزی مربوط به محلول یا گاز خارج شده از ستون که در سیستم‌های معمول مایع یا گاز با آن برخورد می‌کنیم وجود ندارد. ترکیبات جدا شده روی کاغذ مکان‌یابی و شناسایی می‌شوند در نتیجه ، جداسازی به طور نسبتا دائم در روی کاغذ ثبت می‌شود. در این روش اجزای جدا شده جمع آوری نمی‌شوند و احتیاجی به وسایل پیچیده کنترل پیوسته نیست. اندازه گیری کمی ترکیبات جدا شده را می‌توان روی کاغذ انجام داد ولی اگر بخواهند اجرای را از کاغذ خارج کنند. تنها کار لازم این است که قسمت مربوط به هر یک از اجسام را از کاغذ ببرند و هر یک را به طور جداگانه بشویند.

طرح کلی روش

قطره‌ای از محلولحاوی مخلوطی که باید جدا شود را روی یک صفحه یا نوار کاغذ صافی در محل علامت گذاری شده قرار می‌دهند. در این محل ، قطره به صورت یک لکه حلقوی پخش می‌شود. وقتی که لکه خشک شده کاغذ را در یک ظرف مناسب سربسته طوری قرار دهند که یک سر آن در حلال انتخاب شده به عنوان فاز متحرک فرو رود. حلال از طریق الیاف کاغذ در نتیجه عمل موئینگی نفوذ می‌کند و نکته مهم این است که سطح کاغذ نباید کاملا به وسیله حلال پوشانده شود. زیرا در این صورت ، اصلا جدا سازی صورت نمی‌گیرد یا نواحی خیلی پخش می‌شوند.

وقتی که جبهه حلال مسافت مناسبی را طی کرد یا بعد از یک زمان از قبل تعیین شده ، کاغذ را از طرف بیرون آورده ، جبهه حلال را با علامتی مشخص می‌کنند و می‌گذارند تا صفحه خشک شود. وقتی که محل‌های مناطق جدا شده آشکار شدند لازم است که هر یک از اجسام به طور جداگانه شناسایی شوند. در موارد ایده‌آل ، هر جسم با واکنشگر مکان‌یاب ، رنگ مخصوصی می‌دهد که در مورد مواد معدنی بیشتر و درمورد مواد آلی کمتر مشاهده می‌شود. ساده‌ترین روش شناسایی بر اساس مقدار Rf یعنی نسبت فاصله طی شده به وسیله جبهه حلال است.

خارج کردن جسم ازکاغذ

روش‌های ارائه شده مستلزم به کارگیری یک واکنشگر مکان یاب شیمیایی برای تعیین محل لکه هستند، و لکه‌های رنگی اساس ارزیابی را تشکیل می‌دهند. بعضی اوقات می‌توان کمپلکس را شستشو داد و به وسیله روش رنگ سنجی تخمین زد، ولی اگر تغییر شیمیایی قابل قبول نباشد ماده تغییر نیافته را باید شستشو داد. عمل شستشو را می‌توان با وارد کردن تکه کاغذ در یک حلال ، به وسیله استخراج در یک دستگاه سوکسیله ، یا با استفاده از آرایش خاصی ، که در کاغذ یک جریان نزولی کروماتوگرافی ایجاد می‌نماید، انجام داد. برای جداسازی‌های معدنی تکه‌های کاغذ را می‌توان به صورت خاکستر در آورده ، باقیمانده‌ها را در اسید حل کرد. نتایج این روش به اندازه روش شستشو خوب نیستند. از اینرو محلول‌های به دست آمده را می‌توان به وسیله هر روش مناسبی تجزیه کرد، روش‌هایی که اغلب به دنبال روش‌های کروماتوگرافی به کار می‌روند عبارتند از رنگ سنجی و قطبش نگاری.

پیدا کردن یک روش کروماتوگرافی ، که بتواند به طور کمی تمامی اجزای یک مخلوط را جدا کند، مطلقا ضروری نیست. ارزیابی کمی فلزات با قطبش نگاری و ارزیابی کمی مواد آلی مشکل‌تر از فلزات است زیرا ، برای مواد آلی ، روش‌های موجود برای آزمایش محلول حاصل از شستشو محدودتر هستند. ارزیابی مواد آلی معمولا بر روی کاغذ صورت می‌گیرند و بنابراین ، لازم است که هر جسمی از اجسام دیگر به طور کمی جدا شود.

نقایص کروماتوگرافی کاغذی

· لکه‌های چند تایی :
در کروماتوگرافی یون‌ها فلزی ، اگر دارای آنیونی متفاوت از آنیون موجود در محلول اولیه باشد، ممکن است رقابتی بین آنیون‌ها برای یون فلزی وجود داشته باشد، که در نتیجه دو لکه به دست می‌آید که هر یک از آنها مربوط به یکی از نمکهای فلزی می‌باشد. ممکن است یون فلزی دو کمپلکس متفاوت با حلال ایجاد کند. در جدا سازی‌های آلی ، ممکن است جسم دو شکل متفاوت وجود داشته باشد. به عنوان مثال یک آمینو اسید می‌تواند به صورت کاتیون و یون دو قطبی باشد.

· دنباله دار شدن :
اگر مخلوط یه مقدار زیاد از حد روی کاغذ قرار داده شود، یا سرعت عبور حلال متفاوت باشد، جسم نمی‌تواند برای ایجاد یک لکه مجزا به تعادل برسد. در این صورت این لکه ، در سطح بزرگی از کاغذ پخش شده و از حلال در حال پیشروی عقب می‌ماند. دنباله‌دار شدن ممکن است به سبب اثرات جذبی سطحی تر ایجاد شود.

· اثرات لبه یا کناره :
لکه‌ها خیلی نزدیک به کنار نوار ، ممکن است در امتداد کنار کاغذ پخش شوند، عمل نفوذ ممکن است به علت بالا بودن غلظت موضعی فاز متحرک در آن ناحیه ، و یا به علت بالاتر بودن سرعت تبخیر حلال در کنار کاغذ ، که منجر به اثرات تقسیمی غیرعادی می‌شوند، باشد.

روش کمی کروماتوگرافی کاغذی

کاربرد کمی این روش نه تنها احتیاج به یک جداسازی کمی ، بلکه مکان‌یابی و ارزیابی کمی اجسام موجود نیز دارد. یک جداسازی کیفی رضایت بخش ، الزاما برای کار کمی مفید نیست. اندازه گیری کمی را می‌توان یا با سنجش مقدار جسم موجود در لکه روی کاغذ ، یا با خارج کردن جسم از کاغذ و تجزیه اجزای جدا شده به وسیله روش‌های کمی متداول انجام داد. لکه اولیه از نمونه مناسب روی کاغذ قرار می‌دهند، خشک کردن لکه باید تحت شرایط استاندارد زمان و دما صورت گیرد.
در تهیه حلال باید دقت زیادی روی نسبت‌های اجزای صورت گیرد، برقرار ساختن تعادل باید به طور استاندارد انجام گیرد، طول عبور حلال در تمامی نوبت‌ها یکسان باشد، در طول آزمایش ، دما باید ثابت بماند، و خشک کردن ورقه باید در یک زمان و دمای استاندارد انجام گیرد. واکنشگر مکان‌یاب (در صورت استفاده از لکه‌های رنگی) باید به طریق کاملا تکرارپذیر افزوده شود. و هر عمل بعدی ، مانند خشک کردن یا قراردادن در معرض بخار آمونیاک ، باید در مدت استاندارد انجام گیرد. مقدار جسمی که در یک جداسازی کروماتوگرافی باید روی کاغذ قرار گیرد، متغیر است.

موارد استعمال کروماتوگرافی کاغذی

· منابع علمی مربوط به روش‌های تجزیه‌ای و بررسی ترکیبات طبیعی نشان می‌دهد که کروماتوگرافی کاغذی در هر رشته‌ای کاربرد دارد. با این همه ، این روش هنوز هم در جداسازی‌های مواد با ماهیت زیستی وسیعترین کاربرد را دارد.

· کروماتوگرافی کاغذی اکثرا به عنوان یک وسیله تحقیقاتی به کار می‌رود، و به طور گسترده‌ای در تجزیه‌های روزمره مخصوصا در جداسازی‌های جدیدی که هیچ روش کلاسیک برای آنها وجود ندارد، نیز مورد استفاده قرار می گیرد. روش اخیر در مسائل کلینیکی و زیست شیمیایی ، جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین کاربد دارد.

· آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه و قند ، جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدها در آزمایش اسیدهای نوکلئیک ، جداسازی استرئیدها ، تجزیه عمومی ، تجزیه بسپارها ، تشخیص و ارزیابی فلزات در خاک ها و نمونه های زمین شناسی ، بررسی ترکیبات فنلی در عصاره های گیاهی ، جداسازی آلکالوئیدها ، جداسازی ترکیبات علامت دار به وسیله رادیو ایزوتوپ‌ها ، کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مواد فرار غیر فعال مانند هیدروکربن‌ها و دیگری جداسازی اسیدهای چرب با فراریت بیشتر مناسب نمی باشد.

کروماتوگرافی روش جزء به جزء کردن یک مخلوط براساس قطبیت مولکول ها می باشد.کروماتوگرافی شامل یک فاز متحرک(مخلوط) می باشد که می خواهیم جداسازی نماییم واین مخلوط دریک مایع ویا گاز حل شده است و ازروی یک فاز ساکن عبور می نماید اجسام موجود در مخلوط به علت قطبیت متفاوت با سرعت های مختلف ازروی فاز ساکن می گذرند .

سرعت حرکت هر جزء درمخلوط به چند عامل قطبیت بستگی دارد که مهمترین آنها یک جسم قطبی هم به حلال وهم به فازساکن جاذبه دارد جسمی که کندتر حرکت می کند بیشترین جاذبه رانسبت به فاز ساکن دارد.

کروماتوگرافی انواع گوناگون دارد ازجمله :

1- کروماتوگرافی ستونی :که برای جداسازی های فوق العاده حساس مانند جداسازی ویتامین ها ٬ پروتئین ها ٬ وهورمون هابه کار می رود. که باروش های دیگربه آسانی جدا سازی نمی شوند. در این روش فاز ساکن شامل یک ستون شیشه ای یاپلاستیکی است. که باماده ای نظیر آلومینیم اکسید ٬ کلسیم کربنات٬ منیزیم کربنات٬ زغال فعال شده٬ خاک رس٬ ژل ها و یا بسیاری ازترکیبات آلی دیگر پر شده است. اندازه ذرات فازساکن درگستره( 150 تا 200μm ) می باشد. فاز متحرک شامل مخلوط همراه بایک حلال مناسب است که ازبالای ستون اضافه می شود .

2-کروماتوگرافی یونی : دراین مورد ستون رااز رزین تبادل یون پر می کنند. بابه کاربردن رزین مناسب می توان یون های مثبت ویون های منفی راازهم جدانمود .

3- کروماتوگرافی کاغذی : دراین روش به جای ستون شیشه ای از نوارهای کاغذی درظرف سربسته استفاده می شود قطره ای ازمخلوط رابرروی کاغذ گذاشته وانتهای کاغذرادرحلال مناسب قرار می دهند حلال براساس خاصیت موئینگی درکاغذ نفوذ نموده وباعث جداسازی اجزاء مخلوط می شود بردیدن چگونگی این نوع کروماتوگرافی دراینجا کلیک نمایید.

۴- کروماتوگرافی لایه نازک: این تکنیک که غالبا درجداسازی مخلوطهای مواد زیست شناختی مختلف به کار می رود بعضی ازتکنیک واصول به کاررفته درکروماتوگرافی ستونی وکاغذی باهم تلفیق شده است .
5- روماتوگرافی گازی : یک تکنیک کروماتوگرافی برای تجزیه مایعات فرارومخلوط هایی ازگازهاو بخارات می باشد .گازهای که باید تفکیک شوند همراه با یک گاز بی اثر نظیر هلیم درفاز متحرک حمل می شود.

انواع و روش‌های کروماتوگرافی

یکی از پرکاربردترین روش‌های جداسازی مواد در آزمایشگاهکروماتوگرافی است و در مواقعی که جداسازی به روش‌های دیگر ناممکن است به راحتیمی‌توان از این روش استفاده کرد، زیرا اختلافات‌های جزئی موجود در رفتار اجسام باعثتسهیل جداسازی در جریان عبور آن‌ها از یک سیستم کروماتوگرافی می‌شود‌. این روشبسیار ساده و سریع است به طور مثال آزمایشی که ممکن است با استفاده از روش ستونتقطیر چندین روز به طول بینجامد، می‌تواند به کمک کروماتوگرافی در عرض زمانی بسیارکوتاه انجام گیرد، وسایل مورد لزوم آن نیز ارزان قیمت است. مزیت دیگر روش‌های کروماتوگرافی این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است به این دلیل روش‌های تجزیه‌ای مربوط به جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌توانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند.
کروماتوگرافی لغتی یونانی به معنی رنگ نگاری است که ترکیبی از دو واژه "کروما" به معنی رنگ و "گروفین" به معنی نوشتن است. در سال 1903 برای اولین بار از این روش جداسازی مواد رنگی استفاده شد که این کار توسط میخائیل‌سوئت انجام گرفت. اما امروزه از این روش برای جداسازی مواد بی رنگ چون گازها استفاده می‌شود. اساس کروماتوگرافی ، جذب سطحی مواد و توزیع آن‌ها در دو فاز است. در این روش جداسازی بر اساس حرکت نسبی دو فاز صورت می‌گیرد بدین ترتیب که یکی از فازها که فاز ساکن نامیده می‌شود بدون حرکت است و فاز دیگر فاز متحرک نام دارد. با عبور دادن فاز متحرک از داخل فاز ساکن جریانی به وجود می‌آید، در این حالت اجزای مختلف نمونه سرعت‌های حرکت مختلف دارند و جداسازی بر اساس همین اختلاف سرعت‌ها انجام می‌شود. فاز متحرک می‌تواند گاز یا مایع و فاز ساکن می‌تواند جامد یا مایع باشد. لازم به ذکر است که به علت انرژی جنبشی بالای مولکول‌های گازی، فاز ساکن را گاز قرار نمی‌دهند. اگر فاز ساکن جامد باشد، کروماتوگرافی جذب سطحی و اگر فاز ساکن مایع باشد کروماتوگرافی را تقسیمی می‌نامند. نوع دیگری از نام گذاری روش‌های کروماتوگرافی بر اساس ماهیت فاز متحرک و ماهیت فاز ساکن انجام می‌شود. که بدین ترتیب کروماتوگرافی به چهار بخش اصلی طبقه بندی می‌شود. نامی که در ابتدا آورده می‌شود بیان کننده ماهیت فاز متحرک و نام دوم بیان کننده ماهیت فاز ساکن است.
کروماتوگرافی مایع – جامد (LSC)
در این روش جدا شدن بر اساس جذب سطحی یا تشکیل کمپلکس است. کروماتوگرافی LSC در واقع نوعی کروماتوموگرافی جذبی است که مواد بر اساس اختلاف در قابلیت جذب خود روی سطح جامد از یکدیگر جدا می‌شوند. این روش نیز به انواع مختلفی چون کروماتوگرافی جذب سطحی (برای جداکردن مواد شیمیایی غیر مشابه) ، کروماتوگرافی لایه نازک، کروماتوگرافی تبادل یونی و کروماتوگرافی ژلی تقسیم می‌شود.
کروماتوگرافیگاز – جامد (GSC)
در این روش نیز اساس جداسازی جذب سطحی فاز گاز روی سطح جامد است که برای خالص سازی گازها اجسام فرار استفاده می‌شود.
کروماتوگرافی مایع – مایع (LLC یا HPLC)
به دو گونه تقسیمی (برای جدا کردن مواد شیمیایی مشابه) و کاغذی استفاده می شود.
کروماتوگرافی گاز- مایع (GLC یا VPC)
کروماتوگرافی ستون مویین از این نوع است. در LLC و GLC ، مواد بر اساس توزیع بین دو فاز جدا می‌شوند. برای انتخاب نوع روش کروماتوگرافی ابتدا روش‌های ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می شوند و اگر پاسخ گو نباشد به سراغ روش‌های پیچیده‌تر مانند روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HELC) می‌رویم.

حال به توضیح برخی روش های کروماتوگرافی می پردازیم:
کروماتوگرافی جذب سطحی
در این نوع کروماتوگرافی جداسازی بر مبنای تقاوت در جذب سطحی اجزای فاز متحرک و فاز ساکن صورت می‌گیرد. در کروماتوگرافی جذب سطحی، فاز متحرک مایع (حلالی مانند هگزان) و فاز ساکن جامد (مانند آلومین) است بنابراین نوع خاصی از کروماتوگرافی مایع – جامد محسوب می‌شود.
در این نوع جداسازی حلال(فاز متحرک) با عبور خود از میان ستون جامد (فاز ساکن) اجزای مخلوط را با خود حمل می‌کند. سرعت حرکت هر جزء‏ ، به میزان جذب سطحی آن بر روی ماده داخل ستون بستگی دارد. به این ترتیب سرعت ماده‌ای که کم جذب شده است بیشتر از ماده‌ای که زیاد جذب شده است خواهد بود و اجزایی که قابلیت جذب بالاتری دارند، در قسمت بالای ستون و اجسامی که قابلیت جذب کمتر دارند در قسمت‌های پایین ستون ، جذب خواهند شد. حال اگر اختلاف بین جذب‌های سطحی به حد کافی زیاد باشد، جداسازی مواد کامل انجام خواهد گرفت..
کروماتوگرافی لایه نازک
این نوع کروماتوگرافی نمونه ‌ای از کروماتوگرافی جذب سطحی است که در آن، به جای اینکه ستون‌ها از جاذب پر شوند، آن را به صورت لایه نازک روی یک صفحه شیشه‌ای یا لایه پلاستیکی یا ورقه فلزی قرار می‌دهند. سایر اصول جداسازی مانند روش کروماتوگرافی جذب سطحی است.

کروماتوگرافی تبادل یونی
در این روش بین فاز متحرک (محلول) و فاز ساکن (جامد) به صورت برگشت پذیر یون مبادله می‌شود. جامد تشکیل‌دهنده فاز ساکن رزین نامیده می‌شود و پایداری مکانیکی و شیمیایی و یکنواختی اندازه ذرات از خصوصیات آن‌ها است. قالب این رزین‌ها بر پایه یک بسپار بزرگ (معمولا پلی استیرن) استوار است اما برخی از آن ها متکی بر اسید متا اکریلیک هستند، رزین‌ها به دو نوع تعویض کننده آنیونی و کاتیونی تقسیم می شوند. هر کدام از این تعویض کننده‌ها به نوع بازی ضعیف و قوی و اسیدی ضعیف و قوی تقسیم می‌شوند. می‌توان این روش را مانند کروماتوگرافی جذبی در نظر گرفت به گونه ای که رزین‌ها جایگزین جاذب شده باشند. رزین‌ها باید دارای گروه‌های مبادله کننده تک عاملی باشند و درجه اتصالات عرضی کنترل شده داشته باشند. گستره اندازه ذرات نیز باید تا آنجا که ممکن است کوچک باشد. با این روش کروماتوگرافی می‌توان محلول‌های رقیق را به خوبی جداسازی کرد.
کروماتوگرافی ژلی
این نوع کروماتوگرافی برای اولین بار در سال 1954 معرفی و در سال 1959 اصلاح شد. در این روش جداسازی‌های مبتنی بر الک کردن مولکولی بر روی اجسام بی‌بار در جریان مهاجرت الکترو اسمزی از داخل ژل‌ها انجام می‌شود. بدین ترتیب که جداسازی بر مبنای اندازه‌های نسبی مولکول ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به وسیله ژل استفاده می‌شود. ژل استفاده شده در این روش باید بی اثر و پایدار باشد. فاز ساکن از یک قالب متخلخل تشکیل شده که منفذهای آن به وسیله حلالی که فاز متحرک را تشکیل داده پر شده است. از آنجا که اساس جداسازی بر این است که مولکول‌های بزرگ تر از حد وارد سوراخ‌ها نشده و به ترتیب جرم مولکولی از ستون خارج شوند و مولکول‌های کوچک تر بر حسب شدت نفوذشان سوراخ ها را پر کنند پس اندازه سوراخ بسیار مهم است. همچنین گرانروی نمونه نیز اهمیت زیادی دارد و نباید از دو برابر گرانروی شوینده بیشتر باشد. از دیگر عوامل مهم حجم نمونه است بدین ترتیب که هر چه حجم نمونه کمتر باشد، غلظت هر جزء در محلول خارج شده نیز کمتر خواهد بود.
کروماتوگرافی تقسیمی
در این روش که نمونه‌ای از کروماتوگرافی مایع- مایع است، شیوه کار بسیار شبیه به کروماتوگرافی جذب سطحی است و تفاوت این دو روش در ماهیت ماده پر شده در ستون است. همچنین حجم ظرفیت یک ستون تقسیمی، غالبا کوچک تر از ظرفیت یک ستون جذب سطحی بوده و گاهی این اختلاف خیلی زیاد است. فاز ثابت لایه ای از محلول است که روی سطح جامد ناصافی مانند سیلیکاژل قرار دارد و فاز متحرک مایعی غیر محلول در مایع اولی است. سرعت حرکت یک جزء از مخلوط تابع انحلال پذیری آن در فاز ساکن است یعنی جدا شدن اجزا بدین صورت است که اجسامی که بیشتر حل می‌شوند، کندتر از اجسامی که کمتر حل می‌شوند به طرف پایین ستون حرکت می‌کنند. در جریان عبور از ستون ، اجسام میان دو فاز تقسیم شده و جداسازی انجام می‌شود. در این روش ابتدا مخلوط اجسام به صورت یک نوار در ستون در می‌آید که علت آن جذب سطحی یا جذب به وسیله فاز ساکن است. و سپس از روش‌های دیگری برای جداسازی مواد استفاده می شود.
کروماتوگرافیکاغذی
کروماتوگرافی کاغذی نوع خاصی از کروماتوگرافی تقسیمی است که در آن صفحات کاغذی جای ستون پر شده را می‌گیرند. در این روش فاز ساکن آب است و به وسیله جذب سطحی بر روی مولکول های سلولز قرار می گیرد. مولکول‌های سلولز نیز به نوبه خود به وسیله ساختار الیافی کاغذ در وضعیت‌های ثابت نگه داشته می‌شود. در ابتدا کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مخلوط‌های مواد آلی به کار می رفت. اما امروزه برای جداسازی یون‌‌های معدنی استفاده می‌شود. به وسیله این روش هم آنیون‌ها و هم کاتیون‌ها را می‌توان جداسازی کرد.
برای انجام این روش قطره‌ای از محلول حاوی مخلوطی که باید جدا شود را روی یک صفحه یا نوار کاغذ صافی در محل علامت گذاری شده قرار می‌دهند. قطره به صورت یک لکه حلقوی در این محل پخش می‌شود. هنگامی که لکه خشک شده کاغذ را در یک ظرف مناسب سربسته طوری قرار می‌دهند که یک سر آن در حلال انتخاب شده به عنوان فاز متحرک فرو رود، حلال از طریق الیاف کاغذ در نتیجه عمل موئینگی نفوذ می‌کند. پس از گذشت زمان از قبل تعیین شده، وقتی حلال مسافت مناسبی را طی کرد، کاغذ را بیرون آورده و حلال را با علامتی مشخص می‌کنند. پس از خشک شدن صفحه وقتی محل های مناطق جدا شده آشکار شدند هر یک از اجسام به طور جداگانه شناسایی می‌شوند. در موارد ایده‌آل ، هر جسم با واکنش گر مکان یاب ، رنگ مخصوصی می‌دهد که در مورد مواد معدنی بیشتر و درمورد مواد آلی کمتر مشاهده می‌شود. ساده‌ترین روش شناسایی بر اساس مقدار Rf یعنی نسبت فاصله طی شده به وسیله جبهه حلال است.
از نقایص کروماتوگرافی کاغذی می‌توان به مواردی چون لکه‌های چند تایی ، دنباله دار شدن و اثرات لبه یا کناره اشاره کرد. این روش در جداسازی‌ مواد با ماهیت زیستی وسیع ترین کاربرد را داشته و در مسائل کلینیکی و زیست شیمیایی ، جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین به کار گرفته می‌شود. آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه و قند، جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدها در آزمایش اسیدهای نوکلئیک، جداسازی استرئیدها، تجزیه عمومی، تجزیه بسپارها، تشخیص و ارزیابی فلزات در خاک‌ها و نمونه های زمین شناسی، بررسی ترکیبات فنلی در عصاره های گیاهی، جداسازی آلکالوئیدها و جداسازی ترکیبات علامت‌دار به وسیله رادیو ایزوتوپ‌ها از دیگر کاربردهای کروماتوگرافی کاغذی است، البته توجه داشته باشید که برای جداسازی مواد فرار غیر فعال مانند هیدروکربن‌ها و دیگری جداسازی اسیدهای چرب با فراریت بیشتر این روش مناسب نیست.
کروماتوگرافیستون مویین
در این روش که نوعی از کروماتوگرافی گاز- مایع محسوب می شود، لوله مویین بلندی وجود دارد که لایه نازکی از فاز ساکن داخل آن را پوشانده است. قدرت جداسازی ستون‌های مویین پنج برابر ستون‌های معمولی است و زمان جداسازی مواد در این روش کمتر است. همچنین از یک آشکارساز کوچک و

کروماتوگرافی

مطالب مشابه :

کروماتوگرافی

کروماتوگرافی کاغذی

موضوع آزمایش: پروتئین های مرحله حاد بیماری C-Reactive-Protein

گزارش کار آزمایشگاه شیمی آلی

گزارش کار کروماتوگرافی کاغذی