ژل آگاروز

  • پروتكل (الكتروفورز DNA روي ژل آگارز) Electrophoresis

      الكتروفورز: يكي از پركاربردترين تكنيك ها در بيولوژي مولكولي الكتروفورز نام دارد كه اساس آن بسيار ساده است. لغت فورز به معناي حركت و تحرك است و الكتروفورز در واقع حركت ذرات تحت تأثير ميدان الكتريكي را گويند. در اين تكنيك مولكول هاي DNA براساس بار و وزن مولكولي آنها جدا مي شوند.   الكتروفورز DNA روز ژل آگارز: نماي ساده از دستگاه الكتروفورز: دستگاه الكتروفورز شامل يك محيط خلاء، يك الكترود منفي و يك الكترود مثبت در دو طرف ذره باردار مي باشد. اسيدهاي نوكلئيك داراي بار الكتريكي هستند. گروه هاي فسفات روي اسيدهاي نوكلئيك داراي بار منفي هستند. بنابراين رشته DNA داراي بار الكتريكي منفي مي باشد. وقتي كليد باز است يا به عبارتي جريان الكتريكي قطع مي باشد ذره موردنظر در ميدان الكتريكي ثابت است و زماني كه كليد بسته است يا به عبارتي جريان الكتريكي وصل باشد ذره موردنظر به تنهايي و با سرعت شتابدار تا رسيدن به الكترود مثبت حركت كرده و برقراري جريان الكتريكي در تانك الكتروفورز همواره از الكترود منفي به سمت الكترود مثبت است. البته اين مطلب در مورد رشته DNA كه داراي بارالكتريكي منفي است صادق است. تحرك الكتريكي معيار اصلي سنجش در جداسازي مولكول هاست. وجود ضريب اصطكاك f يك عامل مقاوم براي تحرك است. درحالي كه وجود بار باعث زودتر رسيدن ذره به قطب است. هرچه ذره بزرگتر باشد و شكل آن از حالت كروي دور باشد ضريب اصطكاك f بيشتري داشته و تحرك الكتريكي كمتري داراست. درواقع تحرك الكتريكي هر ذره وابسته به شكل و اندازه ذره و بار ذره است و ضريب اصطكاك نيز كميتي است كه ارتباط مستقيم با اندازه و شكل ذرات دارد هرچه ذره به شكل كروي نزديكتر باشد ضريب اصطكاك كمتري دارند.       وسايل موردنياز در الكتروفورز: 1. دستكش 2. كست (cast) و كمب (comb) 3. ترازو (Balance) 4. سمپلر 5. ماكروويو 6. تانك الكتروفورز 7. Power supply (جهت برقراري جريان الكتريكي در تانك الكتروفورز) 8. دستگاه عكسبرداري Gel Doc   مواد موردنياز: 1. پودر آگارز 2. EtBr : اتيديوم برمايد (ماده اي بسيار سمي و موتاژن قوي است) 3. TBE 1x 4. Loading Buffer 5. Marker 6. آب مقطر   1) ژل آگارز: يك ژل پايدار است و قطر روزنه هاي آن بسيار بزرگ است و براي جداسازي ماكرومولكول ها و سوپر مولكول ها استفاده مي شود. از ژل آگارز در الكتروفورز هم به صورت عمودي و هم به صورت افقي استفاده ميشود. اين ژل را در درصدهاي مختلف تهيه مي كنند كه اين مطلب به اندازه قطعه موردنظر بستگي دارد. يعني هرچه اندازة قطعه موردنظر بزرگتر باشد غلظت ژل كاهش مي يابد و برحسب اندازه قطعه ژل آگارز را در cast 60 cc, cast 30 cc تهيه مي كنند. بطور مثال: براي قطعه اي با ميزان 100 bp از ژل آگارز 5/2% استفاده ...



  • دانلود کلیپ زیبا در مورد تهیه ژل آگاروز و انجام الکتروفورز

    کلیپ زیبا در مورد تهیه ژل آگاروز و انجام الکتروفورز دانلود فایل

  • دستگاه الکتروفورز

    دستگاه الکتروفورز روش کار :  اين دستگاه جهت الکتروفورز کردن قطعات بزرگ DNA   در داخل ژل آگارز استفاده مي شود. مدل اين دستگاه CHEF-DRII مي باشد و قادر به الکتروفورز کردن قطعاتي در محدوده 5 تا 6 مگا باز را دارا مي باشد الکتروفورز از شناخته شده ترین روش های آزمایشگاهی برای جداسازی بیومولکول ها است. این روش در سال ۱۸۰۷ توسط Reuss کشف شد. او مشاهده کرد که ذرات خاک رس تحت تاثیر میدان الکتریکی در آب پراکنده می شوند. به طور کلی الکتروفورز حرکت ذرات پراکنده در داخل مایعی تحت تاثیر یک میدان الکتریکی یکنواخت است. همین حرکت در فضایی با میدان الکتریکی غیر یکنواخت دی الکتروفورز نامیده می شود. الکتروفورز بدین دلیل اتفاق می افتد که ذرات معلق در مایع معمولا دارای بار الکتریکی سطحی هستند و میدان الکتریکی نیروی کولونی الکترواستاتیک به این ذرات باردار اعمال می کند. اخیرا شبیه سازی های دینامیک مولکولی، نظریه ای بیان داشته اند مبنی بر اینکه برای انجام الکتروفورز حتما نباید ذرات بار سطحی داشته باشند و حتی ذرات خنثی نیز به علت ساختار مولکولی خاصی که آب به عنوان مایع واسط دارد، می توانند الکتروفورز شوند. نیروی کولونی الکترواستاتیک اعمال شده به بار سطحی، با نیروهای مخالف الکترواستاتیک کاهش پیدا می کند. بر طبق تئوری لایه مضاعف، تمام سطوح بار دار در مایعات با لایه ای از بار مخالف پوشانده می شوند که از نظر مقداری کاملا برابر با بار سطحی است اما با علامت مخالف آن. میدان الکتریکی همانند بار سطحی به این لایه نیرو وارد می کند. مجموع این نیروها برابر است با اولین نیروی نامبرده، اما در جهت مخالف آن. در حقیقت این نیرو به یون های موجود در لایه ثانویه اعمال می شود. این یون ها در فاصله ای از سطح ذره قرار می گیرند و بخشی از این نیروی الکترواستاتیک را از طریق تنش برش سیال به سطح ذره منتقل می کنند این بخش از نیرو که به بدنه ذره وارد می شود، نیروی منفی الکتروفورتیک نامیده می شود. یک نیروی الکتریکی دیگر نیز وجود دارد که مرتبط با انحراف لایه ثانویه است و مربوط به تقارن کروی و رسانایی سطح است و به سبب زیادی یون ها در لایه ثانویه به وجود می آید. این نیرو نیروی تخفیف الکتروفورتیک نامیده می شود. تمام این نیروها با اصطکاک هیدرودینامیک، به تعادل می رسند و باعث حرکت ذرات در سیال می شود. سرعت این حرکت v، متناسب با شدت میدان الکتریکی E است (البته در صورتی که این میدان خیلی قوی نباشد.) ضریب این تناسب تحرک پذیری الکتروفورتیک است که رابطه بین شدت میدان الکتریکی و سرعت ذره را مشخص می نماید: ماکرومولکول هایی مانند اسید نوکلئیک، DNA و پروتئین ها نیز باردار هستند ...

  • جداسازی DNA با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگاروز

    تهیه ژل پلی آکریلامید : قدرت تفکیک سازی این ژل بسیار بالا است و قطعات DNA  با طول کم نیز در این ژل قابل رویت میباشند و بسته به در صد ژل حتی اختلاف یک باز را میتوان در قطعات DNA  الکتروفورز شده مشاهده نمود . 1. شیشه ها، شانه ( Comb )  و فضاسازها ( Spacer)   را با آب و دترژان خوب بشویید و سپس با الکل 70 در صد آنهارا تمیز کنید تا چربی دستها روی آنها باقی نماند ( بجای پنبه  از گاز استفاده کنید زیرا پرزهای پنبه روی شیشه باقی میمانند ) 2. قالب ژل را آماده کرده و جهت جلوگیری از نشت ژل ازداخل آن اطراف آن را با آگارز 1در صد به دقت درز گیری  (Seal) نمایید. 3. حجم قالب (cast ) را  ( حجم ژل) با اندازه گیری طول وعرض قالب مشخص نمایید (قطر ژل بسته به قطر فضا سازها یک و یا نیم میلیمتر است) 4. بسته به در صدژل مورد نظر مقدار آکریلامید و بیس آکریلامید لازم  را (بصورت مخلوط 29  در صد آکریلامید و 1درصد بیس آکریلامید تهیه و در یحچال نگهداری میشود) داخل لوله تمیز بریزید. 5. از بافر 10xTBE  با غلظت نهایی 1x  اضافه کنید وبا آب مقطر به حجم مورد نظر برسانید. 6. مقدار 100 میکرو لیتر آمونیوم پرسولفات 10درصد و 3 میکرو لیتر محلول TEMED  به آن اضافه کنید ( توجه داشته باشید که مونومرهای  اکریلامید وبیس آکریلامید در حال پلیمریزه شدن هستند). 7. به آرامی  محلول را در قالب از قبل آماده شده بریزید و مراقب باشید که حباب هوا وارد آن نشود زیرا حباب هوا مانع انجام الکترو فورز میشود. 8. به آرامی شانه را داخل قالب قرار دهید تا بعد از پلیمریزه شده ژل ، درون آن چاهک هایی جهت نمونه گذاری ایجاد شود. 9. بعد از پلیمریزه شده به آرامی شانه را درآورده و چاهک هارا با آب بشویید تا اگر مونومرهای پلیمریزه نشده هنوزوجود دارد شسته شوند. 10. گیره پایینی   را باز کنید  وفضاساز پایینی   را از قالب خارج کنید. 11. گیره های طرفین را باز کرده و دستگاه را طوری داخل تانک مخصوص قرار دهیدکه قسمت بریده شده  شیشه رویی( Notch ) به سمت محفظه بالایی (  تانک  فوقانی) قرار گیرد. 12. شیشه های دستگاه ( قالب) را با نصب گیره ها ی مخصوص به طرفین تانک,  ثابت نمایید. 13. محفظه های بالا و پایین تانک را با  1xTBE buffer  پرنمایید بطوریکه بافر روی چاهک ها را بپوشاند. چنانچه بین  دوشیشه قالب ( محل خارج کردن فضاساز پایینی ) که در محفظه پایینی تانک قرار دارد حباب هوا مشاهده میشود با یک سرنگ پر از بافر که دار ای سر سوزن کج است حباب هوا را بیرون کنید تا مانع جریان الکتریکی نشود و الکترو فورز بخوبی انجام گیرد. 14. محصول PCR  را ( همانند الکتروفورز با ژل آگارز)  با بافر نمونه گذاری مخلوط کرده و توسط سرنگ هامیلتون نمونه گذاری را روی ژل انجام دهید. 15. محفظه بالایی ...

  • الکتروفورز(محاسن و معایب)

    الکتروفورز       مقدمه به سبب این که ماکرومولکول های زیستی مانند DNA و پروتئین ها ها، دارای بار هستند؛ می‌‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی به نام الکتروفورز استفاده می‌‌شود. الکتروفورز در واقع مهاجرت یون ها در یک میدان الکتریکی است روش های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه ی بیومولکول ها (مولکول های زیستی)، اعم از اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها ابداع شده است و به این منظور، از ژل های مختلفی چون ژل های اکریل آمید، ژل های نشاسته، ژل های آگار و آگاروز و ژل های کاغذی استفاده می شود. به دلیل این که ژل های کاغذی امروزه کاربرد کمتری از انواع دیگر دارند؛ و ژل های نشاسته بیشتر برای جداسازی ایزوزایم ها استفاده می شوند؛ در این نوشتار دو ژل پرکاربرد در تفکیک قطعات  DNA و RNA، یعنی ژل های اکریل آمید و آگاروز، معرفی و مورد بررسی قرار می گیرند. الکتروفورز ژل از یک محیط نیمه جامد (ژل)، به عنوان فاز ثابت استفاده می‌‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده، به دو نوع الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگاروز تقسیم می‌‌شود. الف) الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید (PAGE) الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالایی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک به کار گرفته می‌‌شود. به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، پس از ایجاد میدان الکتریکی، پروتئین ها به حرکت در می آیند و طول ژل را طی می کنند. اما به طور معمول بار مؤثر در ایجاد حرکت، بار خود پروتئین نیست؛ بلکه بار ماده ای است به نام SDS که مولکول بزرگ شوینده ای با بار منفی است؛ که به طور معمول الکتروفورز پروتئین ها در حضور آن انجام می‌‌شود. ترکیب پروتئین + SDS از میان حفره های شبکه ی پلی اکریل آمید عبور کرده، طول ژل را طی می کند. مولکول های کوچک تر سریع تر از مولکول های بزرگ حرکت می کنند؛ زیرا درصد بیشتری از منافذ، مولکول های کوچک را از خود عبور   می دهند. SDS باعث واسرشت شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل می‌‌شود (در صورتی که نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته‌ای باشد؛ از مواد واسرشت کننده نظیر اوره یا فرمالدهید در ژل، هم زمان با الکتروفورز استفاده می‌‌شود. به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می‌‌گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب های اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابر این، تفکیک مولکول ها فقط براساس طول - و نه ساختار دوم- انجام می‌‌شود. در این ژل ها مولکول های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول های بزرگ‌تر، سریع تر حرکت ...

  • درباره ی الکتروفورز

    الکتروفورز ژل<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /> از یک محیط نیمه جامد (ژل)، به عنوان فاز ثابت استفاده می‌‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده، به دو نوعالکتروفورز ژل پلی اکریل آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگاروز تقسیم می‌‌شود. الف) الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید (PAGE) الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالایی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک به کار گرفته می‌‌شود. به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، پس از ایجاد میدان الکتریکی، پروتئین ها به حرکت در می آیند و طول ژل را طی می کنند. اما به طور معمول بار مؤثر در ایجاد حرکت، بار خود پروتئین نیست؛ بلکه بار ماده ای است به نام SDS که مولکول بزرگ شوینده ای با بار منفی است؛ که به طور معمول الکتروفورز پروتئین ها در حضور آن انجام می‌‌شود. ترکیب پروتئین + SDS از میان حفره های شبکه ی پلی اکریل آمید عبور کرده، طول ژل را طی می کند. مولکول های کوچک تر سریع تر از مولکول های بزرگ حرکت می کنند؛ زیرا درصد بیشتری از منافذ، مولکول های کوچک را از خود عبور   می دهند. SDS باعث واسرشت شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل می‌‌شود (در صورتی که نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته‌ای باشد؛ از مواد واسرشت کننده نظیر اوره یا فرمالدهید در ژل، هم زمان با الکتروفورز استفاده می‌‌شود. به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می‌‌گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب های اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابر این، تفکیک مولکول ها فقط براساس طول - و نه ساختار دوم- انجام می‌‌شود. در این ژل ها مولکول های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول های بزرگ‌تر، سریع تر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌‌کنند). به ازای هر 2 اسید آمینه، 1 مولکول SDS به پروتئین متصل می‌‌شود که باعث القای بار منفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌‌شود. در پایان، پروتئین ها یا قطعات DND با وزن مولکولی بالا، در بالای ژل اکریل آمید و آنهایی که وزن مولکولی (برحسب دالتون)، کوچک تری دارند؛ در پایین ژل قرار می گیرند. در واقع یک رابطه ی خطی بین میزان حرکت مولکول ها روی ژل، و وزن مولکولی آنها وجود دارد. از سوی دیگر هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد؛ قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌‌نماید. از روش PAGE برای بررسی جهش‌ها و تعیین توالی DNA استفاده می‌‌شود. محاسن ژل اکریل آمید 1.       چون اندازه ی منافذ ژل اکریل آمید یکسان است؛ در نتیجه اثر غربال سازی حاصل از این خاصیت، باعث افزایش قدرت وضوح این نوع ژل ها می شود. 2.       به دو طریق می توان به سادگی ژل هایی ...

  • تجهیزات71- دستگاه الكتروفورز

    PDF متن کامل تجهیزات آزمايشي در فضاي تعليق معرفي دستگاه الكتروفورز  الكتروفورز از شناخته شده ترين روش هاي آزمايشگاهي براي جداسازي بيومولكول‌ها است. اين روش در سال 1807 توسط Reuss كشف شد. او مشاهده كرد كه ذرات خاك رس تحت تاثير ميدان الكتريكي در آب پراكنده مي شوند. به طور كلي الكتروفورز حركت ذرات پراكنده در داخل مايعي تحت تاثير يك ميدان الكتريكي يكنواخت است. همين حركت در فضايي با ميدان الكتريكي غير يكنواخت دي الكتروفورز ناميده مي شود. الكتروفورز بدين دليل اتفاق مي افتد كه ذرات معلق در مايع معمولا داراي بار الكتريكي سطحي هستند و ميدان الكتريكي نيروي كولوني الكترواستاتيك به اين ذرات باردار اعمال مي‌كند. اخيرا شبيه سازي هاي ديناميك مولكولي، نظريه اي بيان داشته اند مبني بر اينكه براي انجام الكتروفورز حتما نبايد ذرات بار سطحي داشته باشند و حتي ذرات خنثي نيز به علت ساختار مولكولي خاصي كه آب به عنوان مايع واسط دارد، مي توانند الكتروفورز شوند.نيروي كولوني الكترواستاتيك اعمال شده به بار سطحي، با نيروهاي مخالف الكترواستاتيك كاهش پيدا مي كند. بر طبق تئوري لايه مضاعف، تمام سطوح بار دار در مايعات با لايه اي از بار مخالف پوشانده مي‌شوند كه از نظر مقداري كاملا برابر با بار سطحي است اما با علامت مخالف آن. ميدان الكتريكي همانند بار سطحي به اين لايه نيرو وارد مي كند. مجموع اين نيروها برابر است با اولين نيروي نامبرده، اما در جهت مخالف آن. در حقيقت اين نيرو به يون هاي موجود در لايه ثانويه اعمال مي شود. اين يون ها در فاصله اي از سطح ذره قرار مي گيرند و بخشي از اين نيروي الكترواستاتيك را از طريق تنش برش سيال به سطح ذره منتقل مي‌‌كنند اين بخش از نيرو كه به بدنه ذره وارد مي شود، نيروي منفي الكتروفورتيك ناميده مي شود. يك نيروي الكتريكي ديگر نيز وجود دارد كه مرتبط با انحراف لايه ثانويه است و مربوط به تقارن كروي و رسانايي سطح است و به سبب زيادي يون ها در لايه ثانويه به وجود مي‌آيد. اين نيرو نيروي تخفيف الكتروفورتيك ناميده مي شود.تمام اين نيروها با اصطكاك هيدروديناميك، به تعادل مي‌رسند و باعث حركت ذرات در سيال مي شود. سرعت اين حركت v، متناسب با شدت ميدان الكتريكي E است (البته در صورتي‌كه اين ميدان خيلي قوي نباشد.) ضريب اين تناسب  تحرك پذيري الكتروفورتيك است كه رابطه بين شدت ميدان الكتريكي و سرعت ذره را مشخص مي نمايد:   ماكرومولكول هايي مانند اسيد نوكلئيك، DNA و پروتئين ها نيز باردار هستند و مي‌توان با قرار دادن آن‌ها در يك ميدان الكتريكي، بر مبناي خاصيت الكتروفورز آن‌ها را تفكيك كرد. سرعت حركت مولكول‌ها در اين شرايط ...